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同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸的浓度测定方法

时间:2025-04-07    作者: 管理员

专利名称:同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸的浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种同型半胱氨酸诊断试剂盒,同时本发明还涉及测定同型半胱 氨酸浓度的方法,属于医学检验测定技术领域。
背景技术:
测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多种,包括高效液相色谱法(HPLC)、 氨基酸分析仪测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管气相色谱-质 谱,荧光偏振免疫分析(FPIA)、电化学法及酶法等。
高效液相色谱法(HPLC):是经典的参考方法,但其操作比较复杂,试验耗时 比较长,试验数据变异比较大,在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏 振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法先使用还原剂使血样中所有形式的同 型半胱氨酸转变成还原形式,然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质 复合物,将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同, 因此流动相将其洗脱下来的次序也不同,根据这一原理将样品中的不同物质分开, 以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度,将其与标准 品/内标的比值进行比较和计算,就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。
酶联免疫分析法(EIA):是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法,操作 比较方便、快捷,重复性好,方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作, 比较耗时。酶联免疫分析法基本分析原理先使用酶将血样中所有形式的同型半 胱氨酸转变成S-腺苷-L-同型半胱氨酸,然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸 的单克隆或多克隆抗体,采用竞争结合的原理,将不同水平的标准品与酶标抗体 竞争结合,然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止,制作出同型半胱氮 酸浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理,在标准曲线上就可以查 出其同型半胱氨酸的浓度。
离子色谱法主要用于实验研究,临床上较少使用,其基本分析原理是色谱
4分析的一种,主要是其固定相采用离子交换物质,根据其对不同离子的吸附力不 同可将同型半胱氨酸与其它物质分开进行测定。
毛细电泳法主要用于实验研究,有在临床使用的报道。其特点与高效液相 色谱方法相似,其操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。 基本分析原理先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式,
然后与荧光试剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物,将衍生后的样品进 行毛细电泳分析。将样品放置于10千伏左右的高压电场中,因为各种物质所带电 荷不同,其等电点也不相同,因此其在电场中的迁移速度也就不同,根据这一原 理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质分开,再以荧光检测器检测同型半胱氨 酸-荧光物质复合物的荧光强度,将其与标准品/内标的比值进行比较和计算,就可 以测定总同型半胱氨酸的水平。
荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法,该方法完全 自动化仪器分析,具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理样品中游离 同型半胱氨酸和抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同,将样 品、标准品与标抗体竞争结合,采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与 荧光偏振强度的标准曲线,在标准曲线上就可以査出其同型半胱氨酸的浓度。
酶法因应市场需求而新开发出来的测试方法,目前国内有多项专利申请, CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量; CN200410016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶(E.C.2丄U0)及腺苷同型半胱氨 酸酶(E.C.3.3丄1)的循环扩增作用,再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌 呤氧化酶、过氧化物酶等,或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半 胱氨酸含量;CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 产生硫化氢后再与莹光化合物DMPD2HC1作用产生荧光,该方法使用全自动荧光 分析仪测试,具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理用基因重组酶将 同型半胱氨酸分解,所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测 量的荧光化合物。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术,计量还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化,得以测定同型半胱氨酸浓度的方法,同 时,本发明还将给出用以实现该方法的同型半胱氨酸诊断试剂盒,采用该试剂不 仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行同型半胱氨酸浓度测 定,而且测定速度快、准确度高,因而可以得到切实的推广应用。 本发明同型半胱氨酸浓度测定方法原理如下
同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶硫化氢+氨+
a-氧代丁酸
氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l,3-双磷酸+还原型辅酶 这种方法应用同型半胱氨酸-ot,Y -裂解酶(homocysteine desulfhydrase; EC 4.4丄2)酶(偶)联谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶促反应终 点法。同型半胱氨酸-oc,Y-裂解酶酶解同型半胱氨酸反应产生氨,再通过(偶)联 合谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,最终将辅酶(在340nm处没有 吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶 在340mn处吸光度上升的程度,通过测量340nm处吸光度上升的程度,可以测算 同型半胱氨酸的浓度大小。
实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是 单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明同型半胱氨酸诊断试剂盒较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
谷氨酰胺合成酶
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
腺苷三磷酸 甘油醛-3-磷酸
3 mmol/L
10000U/L
12000U/L
12000U/L 12 mmol/L 9 mmol/L 9 mmol/L
本发明的同型半胱氨酸诊断试剂盒可以是单剂,包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、同型半胱氨酸-ot,Y-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。
试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂, 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油 醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、 谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂 盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使 用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶。 辅酶、同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、 谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不 限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂, 直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定同型半胱氨酸浓度的方法,其辅酶可 以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为单试剂,包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
同型半胱氨酸-aj -裂解酶 10000 U/L
谷氨酰胺合成酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
谷氨酸 12mmol/L
腺苷三磷酸 9 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 9 mmol/L试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用前,加 入纯净水,复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时间IO分钟,起始吸光度《0.1,
测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比 例为1/25,反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大约O分钟左右,检测时间 5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下, 检测主波长340nm吸光度上升的程度,从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。 实施例二
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为双试剂,包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
3 mmol/L 12 mmol/L 9 mmol/L 9 mmol/L
腺苷三磷酸 甘油醛-3-磷酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
谷氨酰胺合成酶
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
100 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 12000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间10分钟,起始吸光度《0.1, 测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测同型半胱氨酸样品与试剂1、试剂2 的体积比例为2/20/5,反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大约O分钟左右, 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下, 检测主波长340nm吸光度上升的程度,从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。 实施例三
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为三试剂,包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
谷氨酸 12 mmol/L
腺苷三磷酸 9 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 9mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酰胺合成酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
100mmol/L 500 mmol/L
12000U/L
12000 U/L
100mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。 测定同型半胱氨酸浓度时,在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间
IO分钟,起始吸光度《0.1,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测同型 半胱氨酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为正反 应(上升反应),延迟时间大约O分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下, 检测主波长340nm吸光度上升的程度,从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
申请人经过实验验证,采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同,不另一一例举。
总之,实验证明釆用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.009;吸光度时间反 应曲线应呈上升曲线直至终点;试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达lmmol/L; 试剂测试的不准确度,其相对偏差不超过士5%;试剂测试的精密度(重复性)的 变异系数(CV) 《2%;试剂的灵敏度可达0.009 ±0.005 AA/mmol/L;试剂在 2—8。C下保存,活性可以稳定一年;——本发明灵敏度高、精确度好,线形范围 宽广,稳定期长,足以便于推广应用。
ii
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的同型半胱氨酸的浓度测定方法,其方法原理如下同型半胱氨酸+水 同型半胱氨酸-α,γ-裂解酶 硫化氢+氨+ α-氧代丁酸氨+谷氨酸+腺苷三磷酸 谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶甘油酸-1,3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度,测算出同型半胱氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种同型半胱氨酸诊断试剂盒,主要成分包括缓冲液 稳定剂 辅酶同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶谷氨酰胺合成酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶20-500 mmol/L1-4000 mmol/L1- 6 mmol/L1000——80000 U/L腺苷三磷酸 甘油醛-3-磷酸1000——80000 U/L 1000——80000 U/L1- 50腿ol/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围;在此范围内效果较好,在此范围外, 试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以 配制成液体试剂,直接使用。
3. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、同型半胱氨酸-OC,Y-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、同型半胱氨酸-aj -裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成双剂试剂;试剂 1,由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油 醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶、谷氨酰胺合成酶、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成多剂试剂;试剂 1,由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成;试剂3,由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶组成。辅酶、同型半胱氨酸 -a,Y-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、 甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒,其特征在于还包括稳定剂 1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸诊断试剂盒,同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、同型半胱氨酸-α,γ-裂解酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度上升的程度,从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
文档编号G01N33/68GK101609015SQ200810122828
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司

  • 专利名称:移动内燃设备的燃油监控方法及监控系统的制作方法技术领域:本发明涉及一种监控方法与监控系统,尤其涉及ー种移动内燃设备的燃油监控方法及监控系统。背景技术:对于移动内燃设备,尤其是大型的户外作业设备,如大型的工程机械、重型车辆等,这些移
  • 专利名称:一种用于卷烟烟气中烟草特有亚硝胺分析的前处理装置的制作方法技术领域:本发明属于样品前处理仪器领域,涉及一种用于卷烟烟气中烟草特有亚硝胺分析的前处理装置。背景技术:卷烟燃烧过程产生的烟气中含有数千种化学物质,已经鉴定出的化学成分已经
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  • 专利名称:雷达水平仪中的升高电压处的能量存储的制作方法技术领域:本发明涉及一种使用测量容器中的产品的表面的水平的微波的雷达水平仪系统。 更具体地,本发明涉及这种仪表中的能量存储。背景技术:雷达水平仪适合用于对诸如工艺流体、颗粒复合物和其它材
  • 专利名称:石油井下环境模拟实验装置的制作方法技术领域:本发明属于环境模拟实验测试技术领域,具体地涉及一种模拟石油井下温度、压力、气液介质等环境的实验装置,特别适合油田井下工具及其材料环境模拟实验测试。背景技术:油田开发生产过程中,井下工具需
  • 专利名称:螺丝安装防漏自动检测机的制作方法技术领域:本实用新型涉及一种工艺装备,尤其是涉及一种螺丝安装防漏自动检测机。 背景技术:在所有产品组装中,螺丝安装是制造工艺中不可缺少的一个重要工序,但当产品要求安装多于一个螺丝时,就有可能产生漏装
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