专利名称：一种水环境中雌激素结合体的共检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水环境中有机污染物的检测技术领域，特别是涉及自然水体样品中痕量天然雌激素结合体的提取、净化和仪器检测方法。
背景技术：
由人或哺乳动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，El)、17 β -雌二 醇(17 β-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和人工合成雌激素乙炔基雌二醇(17 a -Ethinyl Estradiol, EE2)是最具潜在雌性化风险的内分泌干扰物(EndocrineDisrupting Compounds,EDCs),在水环境中ng/L浓度水平就会导致鱼类的雌性化。雌激素排出时其雌激素分子结构中C3-或者C7-位置的羟基多被硫酸盐或者葡萄糖醛酸所取代，转变成为无雌激素活性的结合体结构，但在水体或污水处理厂生物酶的作用下，会转化为其单体结构，恢复雌激素活性。近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着Hg/L浓度水平的雌激素。目前，国内外关注自然水体、土壤中雌激素单体的研究比较多，对于环境介质中雌激素结合体的调查研究相对较少，这也包括水环境中雌激素结合体的相关研究。这很大原因归结为水环境中雌激素结合体痕量存在，易受水体基质影响。因次，建立回收率高、重现性好的水环境中天然雌激素结合体分析方法，是进一步研究环境介质中雌激素迁移转化的前提条件。近年来，痕量有机物的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC/MS/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。然而，对于实际环境样品，比如自然水体样品，由于基质干扰作用，使分析方法的准确性和精密性大大降低。因此，如何将水环境中痕量存在的雌激素结合体富集并进行适当净化，成了水环境中雌激素结合体分析的一个瓶颈。
发明内容
本发明的目的是针对水环境中雌激素结合体痕量存在、基质干扰大、前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对水环境样品中四种雌激素结合体雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)的定量测定。本发明的技术方案如下一种检测水环境样品中痕量存在的雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)、17 0-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)的定量测定方法。附图
I为分析方法具体步骤，其特征在于该方法包括如下部分(I)HLB 柱富集水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用盐酸调节pH为3 ;利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg,6cc),活化的顺序为5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及IOmL超纯水，流速为lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱对水样进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min ;萃取结束后真空抽干5min,待净化。⑵NH2柱净化
将用5mL甲醇活化过的Waters公司的NH2柱(500mg,6cc)用固相萃取柱转接头接于干燥的HLB柱下方，接着用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串联装置，去除基质干扰，再用6mL 2%氨水甲醇溶液洗脱NH2柱上的雌激素结合体，洗脱液收集于IOmL玻璃离心管中，控制流速为lmL/min,洗脱液在氮气流下缓慢吹干,加入ImL乙腈/水(1/1, v/v)混合液，漩涡混合，冷藏等待浓度测定。(3)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素结合体液相色谱-串联质谱联用仪器为=Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美国Agilent公司的自动进样器，3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I数据处理软件；色谱柱Nova_PakC18 (3· 9_X 150_X 4 μ m), Waters 公司；离子源电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压-4500V ;温度4500C ;源内气体I (GSl，N2)压力45psi ;源内气体2(GS2，N2)压力45psi ;气帘气体(N2)压力20psi ;扫描方式为多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)压力Medium。雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)进行分离的HPLC流动相梯度洗脱条件详见表I和表2。表I测定雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)和17 β -雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)流
动相梯度洗脱条件
权利要求
1.一种水环境中雌激素结合体的共检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (1)水环境样品前处理 取4L水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用4mol/L的盐酸调节pH为3 ;利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱，活化的顺序为5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及IOmL超纯水，流速为lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱对水样进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min ;萃取结束后真空抽干5min,待净化；将用5mL甲醇活化过的Waters公司的NH2柱用固相萃取柱转接头接于干燥的HLB柱下方,接着用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串联装置，再用6mL 2%氨水甲醇溶液(v/v)洗脱NH2柱上的雌激素结合体，洗脱液收集于IOmL玻璃离心管中，控制流速为lmL/min，洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入ImL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩涡混合，冷藏等待浓度测定； (2)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素结合体 液相色谱-串联质谱联用仪器为=Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美国Agilent公司的自动进样器，3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I数据处理软件； 色谱柱Nova_Pak C18 (3. 9_X 150_X 4 U m), Waters公司；离子源电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压-4500V;温度4500C ;源内气体1(GS1，N2)压力45psi ;源内气体2(GS2，N2)压力45psi ;气帘气体(N2)压力20psi ;扫描方式为多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)压力Medium ;雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 0 -雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、170 -雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)进行分离的HPLC流动相梯度洗脱条件如表I和表2所示 表I测定雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)和17 3 -雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)流动相梯度洗脱条件 #口时间流速乙腈氨水，196。，甲醇可minnL/min%%%00.006507.585.07.510.206507.585.07.521.2065010-080.01O-O32.0065015.070.015-043.0065049-02.049.056.1065050.00.050.066.206507-585.07-5710.006507.585.07.5 表2 测定雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)和17 3-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)流动相梯度洗脱条件
2.根据权利要求I所述的水环境中雌激素结合体的共检测方法，其中所述雌激素结合体为雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate, E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide,E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)。
全文摘要
本发明涉及一种水环境中内分泌干扰物的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对水体样品中雌激素结合体雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)的共检测方法。本方法将采集好的水体样品，采用HLB固相萃取小柱富集其中的E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G，再将活化好的NH2柱接于HLB柱下方，用甲醇淋洗，最后用2％氨水甲醇溶液洗脱，利用液相色谱-串联质谱联用分析。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析水体样品中痕量存在的雌激素结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G。
文档编号G01N30/88GK102636610SQ20121012753
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者刘晓薇, 史江红, 吴唯, 张晖, 薄婷, 贾彦舶, 陈庆彩 申请人:北京师范大学
