专利名称：高通量的rsv蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒滴度的定量检测法，特别是涉及一种用于药物筛选及生物样品检验的RSV(Respiratory Syncytial Virus,呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其高通量检测试剂盒。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(RSV)是在婴儿时期和儿童早期导致支气管炎和肺炎的主要原因。该病毒通常会引起再感染。再感染一般发生在成年人中。在老人和缺乏免疫力的病人当中，可能导致下呼吸道的严重疾病。通常病情会持续两到三周.在婴儿和有高风险病情的儿童中，RSV(呼吸道合胞病毒)感染可能会危及患者的生命。病毒性支气管炎是一个严重的传染�。莨兰泼磕暌�100万人死亡，其中大多数病例是由RSV(呼吸道合胞病毒)引起的。出生后第一年，高达70% 80%比例的婴儿将感染RSV (呼吸道合胞病毒)。目前尚无有效的疫苗或小分子药物用来防治RSV(呼吸道合胞病毒)感染。因此，用快速、高效的方法来筛选获得抗RSV(呼吸道合胞病毒)的有效药物是研发新药的有效手段。在抗病毒药物筛选方法中，目前主要使用细胞病变效应(CPE)法。其检测方法有四甲基偶氮唑盐(以下简称MTT)法，或者使用Cell Counting Kit_8 (CCK-8试剂盒)进行检测。其中，MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。而CCK-8试剂盒是基于WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)`-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐的检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系，即生成的甲臜量与活细胞数量成正比。但这些CPE法灵敏度低，通量亦不适于大量化合物的筛选。酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测抗原，后者用于测定特异性抗体。ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，具有适宜于大规模筛查试验、又可以用于少量标本的检测、既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，因此，具有广泛的使用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒。本发明改变了目前筛选抗病毒药物的方法，提高了筛选通量，缩短了筛选周期(可以缩短60%以上的时间)，同时该方法也用于临床或非临床样品的定量检测。为解决上述技术问题，本发明的用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法，包括步骤A、对于非临床样品，其检测步骤，包括H印2细胞的培养阶段、RSV (呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。所述非临床样品包括化合物；临床样品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；临床前样品包括动物模型组织提取物等。所述A中的H印2细胞的培养阶段，步骤包括①将Ifep2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37°C、5% CO2、培养16-24小时；②待检测样品(非临床样品，如化合物)加入上述接种有细胞的培养板中；③加入RSV (呼吸道合胞病毒)至上述培养板中；④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50 μ I ； 所述培养阶段③中，加入RSV (呼吸道合胞病毒)的量为50-150倍TCID5tl (Tissueculture infective dose,半数组织培养感染剂量)病毒稀释液,体积为10_40ul。所述A、B中的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA检测阶段，步骤包括①在384孔酶标板内加入羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体，经孵育、洗涤后，加入封闭试剂作用，然后洗涤；②在384孔酶标板内加入待测样品(包括细胞培养上清，临床或临床前样品)经孵育、洗涤后，加入生物素结合羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体，经孵育、洗涤；③在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶，经孵育、洗涤后，加入TMB(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine,四甲基联苯胺)显色液作用后，再加入TMB终止液；④在450nm波长处测量酶标板的吸光值。所述ELISA检测阶段中，所涉及的所有洗涤是使用PBS-Tween 20 (PBST)洗涤3次以上。所述ELISA检测阶段的步骤①中，羊抗RSV多克隆抗体加入量为羊抗RSV多克隆抗体(ViroStat-0601)的I 480-1 2000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时；封闭试剂为O. 5% -2%的BSA(牛血清白蛋白)，加入量为每孔100-120μ 1，4°C过夜或者37°C孵育2-4小时。所述ELISA检测阶段的步骤②中，待测样品的加入量为10-50 μ I (样品或样品稀释液)，待测样品孵育的条件为25°C过夜或者37°C孵育1-3小时；生物素结合羊抗RSV多克隆抗体的加入量为生物素结合羊抗RSV多克隆抗体(ViroStat-0607)的I 2000-1 10000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时。
所述ELISA检测阶段的步骤③中，抗生物素过氧化蛋白酶的加入量为抗生物素过氧化蛋白酶(Sigma-E2886)的I 1000-1 4000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育20-40分钟；TMB显色液(Sigma_T0440)的加入量为每孔30-60 μ 1，常温作用2-15分钟；ΤΜΒ终止液(TMB底物终止液，Sigma_S5814)加入量为每孔30-60 μ I。另外，本发明还公开了一种RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测试剂盒，可应用于药物筛选及生物样品检验。该定量检测试剂盒包括=RSV蛋白含量的ELISA检测试剂，还可包括384孔酶标板。其中，RSV蛋白含量的ELISA检测试剂包括羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体、生物素结合羊抗RSV (呼吸道合胞病毒)多克隆抗体、抗生物素过氧化蛋白酶、封闭试齐U、洗涤液、TMB显色液、TMB终止液。所述定量检测试剂盒，还包括H印2细胞、RSV (呼吸道合胞病毒)。所述定量检测试剂盒的检测步骤按照如上所述的步骤进行。本发明通过运用酶联免疫吸附检测原理，发现了一种呼吸道合胞病毒专一性的定量检测法，此法可用于高通量的抗呼吸道合胞病毒药物筛选以及临床或非临床样品的定量检测，其具有的有益效果如下(I)区别于现有的ELISA应用范围和目前的筛选技术(MTT或者CCK8试剂盒)，本发明采用ELISA法，利用384孔板进行抗RSV (呼吸道合胞病毒)病毒化合物筛�。�(2)采用ELISA法筛选药物，具有灵敏度高、特异性强、操作简单快速、实验稳定、重复性高以及易于自动化操作等特点，而且可以在一天之内检测数千份样品；(3)通过采用384孔板进行ELISA筛�。梢源蟠筇岣呤笛榈耐浚移浼觳饩级�、灵敏度较传统的96孔板高(如图1所示)，实验周期可以完成上万个化合物筛选的工作量，时间缩短了 60%以上 ；原先使用96孔板，即最多只可检测96个样本，使用384孔板，则一次可以检测384个样本，同样使用384孔板进行实验，会使得实验成本也降低了不少，因此，本发明在节省时间的同时，节省了大量试剂，节约了成本；(4)本发明不仅适用于筛选化合物，还适用于临床标本检测或者动物样品的检测，而且所有的操作均可使用仪器完成，降低了人为因素和耗材使用。
图1是在相同条件下，使用384孔板和96孔板进行RSV的ELISA检测的结果图；其中，横坐标是RSV病毒含量滴度，单位为pfu/ml，纵坐标为OD值。如对于同样的样品，在384孔板中测得的OD值(多次平均值)为1. 77，在96孔板中测得的值则为1. 55，读数高出了 14%，因此，384孔板中的ELISA检测灵敏度高于96孔板。图2是实施例1的ELISA检测结果图。下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明
具体实施例方式实施例1非临床样品RSV (呼吸道合胞病毒)定量、高通量ELISA法检测一、细胞培养阶段(I)将H印2细胞(ATCC-CC123)以3000个细胞，体积为30 μ I接种入384孔细胞培养板(Greiner-781080，美国)，在细胞培养箱(37°C、5% CO2)中培养16小时；(2)稀释非临床样品(即化合物1，来源于客户)，根据终浓度50 μ Μ、10 μ Μ、2 μ M、O. 4 μ Μ，分别从母液(IOmM)中取300nL、60nL、12. 5nL、2. 5nL，加入至接种有细胞的384孔培
养板；(3)稀释RSV (呼吸道合胞病毒)(ATCC-VR26)，加入的量为100倍TCID5tl病毒稀释液，体积为30 μ I ;(4)在细胞培养箱中，培养上述384孔培养板96小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。二、ELISA筛选化合物(I)在384孔酶标板(Thermo-Nunc-464718)内加入羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体(ViroStat-0601，l 1000倍稀释，每孔加入50 μ I)，37°C孵育1. 5小时;(2)使用 PBS-Tween 20 (PBST) [PBS (Thermo-Hyclone-SH30264. 01)，含有 O.1 %Tween20 (sigma_P2287)(体积百分比)洗漆3次；(3)在384孔酶标板内加入封闭试剂——1% (体积百分比)的BSA，加入量为每孔 120μ 1，4°C过夜；(4)使用 PB S-Tween 20 洗涤 3 次；(5)在384孔酶标板内加入上述细胞培养上清稀释液50 μ I (样品稀释10倍液)，待测样品孵育的条件为37°C孵育2小时；(6)使用 PBS-Tween 20 洗涤 3 次；(7)在384孔酶标板内加入生物素结合羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体(ViroStat-0607,1 6000倍稀释，每孔加入50 μ I)，孵育的条件为37°C孵育2小时；(8)使用 PBS-Tween 20 洗涤 3 次；(9)在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶(Sigma_E2886，l 2000倍稀释，每孔加入50 μ I)，37°C孵育30分钟；(10)使用 PBS-Tween 20 (PBST)洗涤 3 次；(11)在384孔酶标板内加入TMB (Sigma_T0440，每孔加入50 μ I)显色液，常温作用3分钟后，再加入TMB终止液(Sigma-S5814,每孔加入50 μ I)；(12)利用酶标仪(Molecular Device_340PC384)，在 0D450nm 处测量 384 孔酶标板的吸光值。以上步骤中同时设置有相应的对照，测量结果见下表1:表I
权利要求
1.一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量检测法，包括步骤 A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Ifep2细胞的培养阶段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤； B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。
2.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述非临床样品包括化合物； 临床样品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液； 临床前样品包括动物模型组织提取物。
3.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述A中的H印2细胞的培养阶段，步骤包括 ①将H印2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37°C、5%CO2、培养16-24小时； ②将非临床样品加入上述接种有细胞的培养板中； ③加入呼吸道合胞病毒RSV至上述培养板中； ④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。
4.如权利要求3所述的定量检测法，其特征在于所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50 μ I ； 所述培养阶段③中，加入呼吸道合胞病毒RSV的量为50-150倍TCID5tl病毒稀释液，体积为 10_40 u I ο
5.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述Α、B中的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测阶段，步骤包括 ①在384孔酶标板内加入羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤后，加入封闭试剂作用，然后洗涤； ②在384孔酶标板内加入待测样品经孵育、洗涤后，加入生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤； ③在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶，经孵育、洗涤后，加入TMB显色液作用后，再加入TMB终止液； ④在450nm波长处测量酶标板的吸光值。
6.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于所述ELISA检测阶段中，所涉及的所有洗涤是使用PBS-Tween 20洗涤3次以上； 所述ELISA检测阶段的步骤①中，羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体加入量为羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的1: 480-1 2000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时； 封闭试剂为0.5% -2%的BSA，加入的量为每孔100-120μ 1，4°C过夜或者37°C孵育2-4小时。
7.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于所述ELISA检测阶段的步骤②中，待测样品包括细胞培养上清，临床或临床前样品； 待测样品的加入量为10-50 μ 1，待测样品孵育的条件为25°C过夜或者37°C孵育1_3小时； 生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的加入量为生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的1: 2000-1 10000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时。
8.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于所述ELISA检测阶段的步骤③中，抗生物素过氧化蛋白酶的加入量为抗生物素过氧化蛋白酶的1: 1000-1 4000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育20-40分钟； TMB的加入量为每孔30-60 μ 1，常温作用2-15分钟； TMB终止液的加入量为每孔30-60 μ I。
9.如权利要求1所述的一种应用于高通量药物筛选及生物样品检验的定量检测试剂盒，其特征在于所述定量检测试剂盒包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测试剂。
10.如权利要求9所述的定量检测试剂盒，其特征在于所述定量检测试剂盒，还包括H印2细胞、呼吸道合胞病毒RSV、384孔酶标板； 所述呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测试剂包括羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体、生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体、抗生物素过氧化蛋白酶、封闭试剂、洗涤液、TMB显色液、TMB终止液。
全文摘要
本发明公开了一种高通量的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒，其定量检测法包括步骤A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Hep2细胞的培养阶段、RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；所述定量检测试剂盒包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA检测试剂。本发明改变了目前筛选抗病毒药物的方法，提高了筛选通量，缩短了筛选周期，可以节约60％以上的时间。同时也用于大量临床或非临床样品中RSV的高通量定量检测。
文档编号G01N33/569GK103048450SQ20111031051
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者彭祥翔, 李少华, 陆恒 申请人:上海药明康德新药开发有限公司, 苏州药明康德新药开发有限公司
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