亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：IgA缺乏者筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，尤其涉及IgA缺乏者检测技术，特别是一 种IgA缺乏者筛查试剂盒。
背景技术：
IgA是一种免疫球蛋白，根据其a链的不同，可以分为IgAl和IgA2 亚类。IgA2亚类有两种同种异型A2m (1)和A2m (2) ， A2m (1)多见于白 种人，A2m (2)多见于黑人和东方人种。在白人中约有1 / 700 (日本人约 为l/ 18500)血清中IgG和IgM含量正常，而lgA低于0.05g/L，称为IgA
缺乏症。
IgA引起的输血免疫反应主要有两种， 一种是IgA缺乏症患者受到免疫 刺激后，可产生抗IgA，若输入含有IgA的血液或血液制品，则导致输血反 应；另一种是IgA的不同亚类、亚型之间的血型不相容性输血，也会产生 免疫性输血反应。目前在美国、加拿大、欧洲等国已建立IgA缺乏者档 案。而我国尚没有开展对IgA缺乏者的筛查，故不能提供IgA(-)的血液。 因此，我国IgA缺乏症患者的输血存在很大风险。
IgA引起的输血后过敏反应轻重不一，重度可发生过敏性休克和死 亡。我国近年来，已有多篇关于IgA输血反应的报道。但至今，IgA过敏 性输血反应发生率还没有可靠的评估，因为诊断未标准化，大多数严重过敏 性输血反应患者缺乏实验室检查与随访。我国缺乏对IgA缺乏症患者的检 测，更缺乏提供IgA(-)的血液或血液制品。所以目前我国IgA缺乏症患者 的输血存在很大风险。
基于工gA引起输血免疫反应的严重性，对于有过敏性输血反应病史和 实验室确诊IgA缺乏症患者的输血须慎重，必须输注采自IgA缺乏者IgA(-) 献血员的血浆或血小板。若在输血紧急，且无IgA(-)血液或血液制品时，
3可考虑采用去除IgA( 〈 1.2ug/ml)的静注免疫球蛋白，或采用经多次洗 涤后的红细胞，许多血液中心要求洗涤5次，使白蛋白和免疫球蛋白除去 率超过95%。以减低IgA过敏反应再次发生的风险。
现有技术中，有采用放射免疫技术来进行IgA筛查检测的方法，这种 方法对实验室要求高，有放射污染，操作复杂，不适合针对献血员的筛査 工作，不利于推广应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种IgA缺乏者筛查试剂盒，所述的这种IgA缺 乏者筛查试剂盒要解决现有技术中IgA缺乏检测时间长、实验室要求高、 对检测人员有危险的技术问题。
本发明的这种IgA缺乏者筛査试剂盒由试剂和盒体构成，所述的试剂 放置在盒体中，其中，所述的试剂由样品稀释液、抗体稀释液、洗板液、 封闭液、终止液、包被抗体、酶标二抗、人lgA抗原标准品和3， 3' ，5， 5'-四甲基联苯胺组成，所述的样品稀释液是氯化钠水溶液，在所述的氯 化钠水溶液中，氯化钠的重量百分比在0.8 1.0%之间，所述的抗体稀释 液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0. 08 0. 12 mol/L之
间，磷酸盐缓冲液中加入有曲拉通x-ioo，所述的曲拉通X-100在磷酸盐缓
冲液中的重量百分比在0. 8 1. 2。％之间，所述的洗板液是磷酸盐缓冲液， 磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0. 12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚 氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸 盐缓冲液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之间，所述的封闭液是磷酸盐缓 冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0. 12mol/L之间，磷酸盐缓冲 液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和脱脂奶粉，所述的聚氧乙烯山 梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之间， 所述的脱脂奶粉在磷酸盐缓冲液的重量百分比在4. 0 6. 0%之间，所述的 终止液是硫酸，所述的硫酸的浓度在1.8 2.2mol/L之间，所述的包被抗
4体是羊抗人IgA抗体，所述的酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗人抗 体。
进一步的，所述的抗体稀释液的PH值在7 7.4之间。
进一步的，所述的洗板液的PH值在7 7.4之间。
具体的，本发明中采用的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)， 其英文名称为Emulsifier-20; Tween-20、分子式为C58H113026、分子 量为1226. 48，是无色透明液体。略带苦味，溶于水或极性溶剂，不溶于 矿物油及植物油。属非离子型表面活性剂，HLB值为16.9，具有良好的乳 化、润湿、增容作用。
在本试剂盒中，样品稀释液的作用是将样品血清1: 10000稀释；抗
体稀释液的作用是将抗体l: 50000稀释；洗板液的作用是将未结合的抗 原、抗体及蛋白洗脱；封闭液的作用是将酶标板中未结合包被抗体的结合 位点封闭，避免实验假阳性的产生；终止液的作用是终止HRP对TMB的 催化作用，使蓝色TMB变为黄色；包被抗体的作用是将抗体于酶标板
上；酶标二抗的作用一是与已和包被抗体相结合的lgA抗原结合，二是使 标记的HRP催化加入的TMB变为蓝色；IgA抗原标准品作用是建立此实 验的标准曲线；TMB的作用是被HRP催化后变色，使阳性孔变色为蓝 色。
本发明的工作原理是利用固定于酶标板上的抗体和酶标二抗分别与 样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标 抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗 原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测 范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值)，即可确定待测抗原含量。
本发明与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明因快速、 经济、简便、检测数量大，本发明的IgA的检测试剂盒可以应用于临床医疗单位及血站的常规血液检测，为IgA缺乏症患者减少输血风险，提高了
输血的安全性。
具体实施例方式
本发明的IgA缺乏者筛査试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂放 置在盒体中，其中，所述的试剂由样品稀释液、抗体稀释液、洗板液、封
闭液、终止液、包被抗体、酶标二抗、人IGA抗原标准品和3， 3' ，5， 5'-四甲基联苯胺组成，所述的样品稀释液是氯化钠水溶液，在所述的氯 化钠水溶液中，氯化钠的重量百分比在0.8 1.0%之间，所述的抗体稀释 液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0. 08 0. 12 mol/L之
间，磷酸盐缓冲液中加入有曲拉通x-ioo，所述的曲拉通X-100在磷酸盐缓
冲液中的重量百分比在0. 8 1. 2%之间，所述的洗板液是磷酸盐缓冲液， 磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0. 12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚 氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸 盐缓冲液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之间，所述的封闭液是磷酸盐缓 冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0. 12mol/L之间，磷酸盐缓冲 液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和脱脂奶粉，所述的聚氧乙烯山 梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之间， 所述的脱脂奶粉在磷酸盐缓冲液的重量百分比在4. 0 6. 0%之间，所述的 终止液是硫酸，所述的硫酸的浓度在1.8 2.2mol/L之间，所述的包被抗 体是羊抗人IgA抗体，所述的酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗人抗 体。
进一歩的，所述的抗体稀释液的PH值在7 7. 4之间。 进一歩的，所述的洗板液的PH值在7 7.4之间。 实施例 检测方法如下
器材96孔平底板，试管，湿盒，水浴箱，酶标仪，吸水纸，移液器使用抗体稀释液将包被抗体(一块板50ul)稀释20倍，再使用双蒸水 稀释至200倍终浓度，每孔加入稀释后抗体100ul。 4° C孵育过夜使用 TW-PBS洗板3次扣干后加入200ul封闭液37° C水浴30min，后再洗板3 次扣干，4° C低温保存。
平底板每孔加入10000倍稀释的待测血清100ul， 37° C水浴l小时。
将孔内液体甩干，使用TW-PBS洗板5次，扣干，每孔加入40000倍稀 释的酶标二抗100ul， 37° C水浴l小时。
将孔内液体甩干，使用TW-PBS洗板5次，扣干，每孔加入TMB100ul， 暗室反应5-8分钟，后加入2M硫酸终止反应进行。
酶标仪读取结果。
酶标仪读数0D值转化为浓度后低于50ng/ml (0. 05ng/ul)即为阴性。 96孔板格局
标准 卩 1 口口 1标准样品 i样品 1样品 9样品 9样品 17样品 17样品 25样品 25样品 33样品 33
标准 口口 z标准 口 ， 口口 Z样品 2样品 2样品 10样品 10样品 18样品 18样品 26样品 26样品 34样品 34
标准 口口 j标准 口 3 口口 j样品 3样品 3样品 11样品 11样品 19样品 19样品 27样品 27样品 35样品 35
标准 品4标准 品4样品 4样品 4样品 12样品 12样品 20样品 20样品 28样品 28样品 36样品 36
标准 口《 口口 ^标准 口 《 口n样品样品样品 13样品 13样品 21样品 21样品 29样品 29样品 37样品 37
标准 口《 口口 t)标准 口口 ()样品 6样品 6样品 14样品 14样品 22样品 22样品 30样品 30样品 38样品 38
标准 叩/标准 口口 /样品样品 7样品 15样品 15样品 23样品 23样品 31样品 31样品 39样品 39
空白空白样品 8样品 8样品 16样品 16样品 24样品 24样品 32样品 32样品 40样品 40
将标准品以500ng/ml为初始浓度倍比稀释后加入空内，
标准
品1-7:
即:500ng/ml (标准品1) 、 250ng/ml (标准品2) 、 125ng/ml (标 准品3 ) 、 62.5ng/ml (标准品4 ) 、 31.25ng/ml (标准品5 ) 、 15.6ng/ml
(标准品6) 、 7.8ng/ml (标准品7) 样品1 40分别是40个测试者的待测血清样品。
权利要求
1.一种IgA缺乏者筛查试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂放置在盒体中，其特征在于所述的试剂由样品稀释液、抗体稀释液、洗板液、封闭液、终止液、包被抗体、酶标二抗、人IgA抗原标准品和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺组成，所述的样品稀释液是氯化钠水溶液，在所述的氯化钠水溶液中，氯化钠的重量百分比在0.8～1.0％之间，所述的抗体稀释液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08～0.12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有曲拉通X-100，所述的曲拉通X-100在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.8～1.2％之间，所述的洗板液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08～0.12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04～0.06％之间，所述的封闭液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08～0.12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和脱脂奶粉，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04～0.06％之间，所述的脱脂奶粉在磷酸盐缓冲液的重量百分比在4.0～6.0％之间，所述的终止液是硫酸，所述的硫酸的浓度在1.8～2.2mol/L之间，所述的包被抗体是羊抗人IgA抗体，所述的酶标二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗人抗体。
2. 如权利要求l所述的IgA缺乏者筛查试剂盒，其特征在于所述的抗 体稀释液的PH值在7 7. 4之间。
3. 如权利要求l所述的IgA缺乏者筛査试剂盒，其特征在于所述的洗 板液的PH值在7 7.4之间。
全文摘要
一种IgA缺乏者筛查试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂由由样品稀释液、抗体稀释液、洗板液、封闭液、终止液、包被抗体、酶标二抗、人IgA抗原标准品、TMB组成，本发明的IgA的检测试剂盒可以应用于临床医疗单位及血站的常规血液检测，为IgA缺乏症患者减少输血风险，提高了输血的安全性。
文档编号G01N33/543GK101661035SQ20081004209
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者冯明亮, 刘达庄, 彪 印, 彤 沈 申请人:上海血液生物医药有限责任公司;上海市血液中心