检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体涉及检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染�。砸鸺粑栏腥尽⑸鲅�、产蛋下降为主要特征，可引起幼鸡死亡率高达40%，成年鸡感染后产蛋量下降10%-50%，给世界养鸡业带来重大的经济损失。鸡传染性支气管炎病毒具有多种血清型和多组织嗜性，自1931年最早报道呼吸型IB以来，随后报道了肾型、肠型、生殖道型、腺胃型等传染性支气管炎，至今已经报道的血清型达30余种，近年来新的血清型和变异株仍不断出现，给流行病学的研究和防疫带来了极大地困难，也给养鸡业造成了严重的经济损失。我国的免疫鸡群和非免疫鸡群均易发生嗜肾型IBV的感染，其中已经报道的有嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株、HF2株等。嗜肾型鸡传染性支气管炎的控制关键之一在于建立快速诊断的方法。分离病毒是诊断本病最经典可靠的方法，但是用时较长，而且常因同时感染的其他病毒影响而漏检；琼脂扩散试验(AGP)操作简单，但是灵敏度低，沉淀抗体持续时间较短，不适合疫苗免疫效果的评价；病毒中和试验(VNT)可以用于检测IB的抗原和抗体，敏感、特异，并可用于病毒的分型，但是实验操作复杂，费时而且昂贵；微量血凝抑制(HI)实验操作简单、快速，易于推广，具有早期诊断的价值，但是鸡传染性支气管炎病毒无自然血凝活性，必须经过特殊处理才可以凝集红细胞，这也限制了 HI在IBV抗体检测中的应用；RT-PCR检测方法具有敏感、快速、特异等特点，但是对实验室条件要求高，操作复杂，难以推广。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒抗体。本发明的另一目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒。本发明提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原的酶标板。采用如下方法制备所述酶标板
Ca)向酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为0. 59 9. 44 u g/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液，4°C包被过夜；
(b)洗涤；
(C)用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤；
Cd)向酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为104. 2 208. 4 u g/mL的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原溶液，37°C孵育1.5 h，洗涤。步骤(a)中所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液的浓度为2. 36 u g/mL。步骤(d)中所述加入到酶标板每孔中的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原溶液的浓度为138. 90 u g/mL。该试剂盒还包括
(1)IOX洗涤液pH7. 4，体积100 mL ;所述IOX洗涤液是含有质量浓度分别为5%Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液；
(2)10X血清稀释液pH7.4，体积100 mL ;所述IOX血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液；
(3)酶标试剂辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25mL ；
(4)底物显色液，包括
A液将I mL浓度为10 mg/mL的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液加入到100 mL浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液的配制方法为0. I mol/L磷酸二氢钠水溶液87. 7 mL和0. I mol/L磷酸氢二钠水溶液12. 3 mL混合即成；
B液体积浓度为3%的H2O2水溶液，10 mL ；
(5)终止液2mol/L 的 H2SO4 溶液 100 mL ；
(6)标准阳性血清即标准IBV抗体阳性血清,0.5 mL ；
(7)标准阴性血清即标准IBV抗体阴性血清，0.5 mL。本发明还提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体的酶标板。所述酶标板的制备方法如下
Ca)在酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为0. 59 9. 44 y g/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液，4°C包被过夜；
(b)洗涤；
(C)用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液浓度为2. 36 V- g/mLo该试剂盒还包括
(1)10X洗涤液pH7. 4，体积100 mL ;所述10X洗涤液是含有质量浓度分别为5%Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液，；
(2)10X血清稀释液pH7.4，体积100 mL ;所述10X血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液，；
(3)酶标试剂辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25mL ；
(4)底物显色液，包括
A液将I mL浓度为10 mg/mL的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液加入到100 mL浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液的配制方法为0. I mol/L磷酸二氢钠水溶液87. 7 mL和0. I mol/L磷酸氢二钠水溶液12. 3 mL混合即成；
B液体积浓度为3%的H2O2水溶液10 mL ；
(5)终止液2mol/L 的 H2SO4 溶液，100 mL ；
(6)标准阳性血清即标准IBV抗体阳性血清,0.5 mL ；
(7)标准抗原嗜肾型IBVDSlO株灭活纯化抗原，I mL ；
(8)阴性标准品对照13日龄SPF鸡胚尿囊液，ImL。本发明为检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体提供了安全、特异、敏感、快速、操作简便、经济的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫抗体。抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体是由高效的杂交瘤细胞2G4分泌的，效价高达1:102000，该单克隆抗体能够特异性地结合嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒。本试剂盒的成本低，可以大量生产，易于工业化应用。

图I是纯化腹水的SDS-PAGE分析图，其中泳道I为蛋白质标准分子量标准(DM101，北京全式金生物技术有限公司);泳道2为未纯化的2G4腹水；泳道3为用亲和层析柱纯化的2G4腹水。图2表示抗原抗体作用时间对检测结果的影响，其中“单抗-抗原”是指抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体与灭活纯化抗原之间的相互作用；“抗原-血清”是指灭活纯化抗原与标准血清之间的相互作用；“血清-酶标二抗”是指标准血清与酶标二抗之间的相互作用。
具体实施例方式实施例中使用的试剂
(I)PBS缓冲液氯化钠(NaCl) 8. 0 g，氯化钾(KCl ) 0. 2 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H20) 2. 9 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0. 2 g，加去离子水溶解后定容至I, 000 mL,用I M氢氧化钠(NaOH)调pH值为7. 4，121°C灭菌15 min，4°C保存。(2) PBST缓冲液含质量浓度为0. 5% Tween-20的PBS缓冲液。(3)碳酸盐缓冲液含有 0. 05 mol/L Na2CO3 和 0. 05 mol/L NaHCO3 的水溶液，pH值为9.6。(4) 1% BSA-PBST :含质量浓度为1%牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)的PBST缓冲液。(5)0. 5% BSA-PBST :含质量浓度为0. 5%牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)的PBST缓冲液。
(6) TEN 缓冲液pH7. 4，浓度为 50 mmol/L 的 Tris-HCL 缓冲液中含有 50 mmol/LNaCl、5 mmol/L Na2EDTA 。实施例一抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株(简称嗜肾型IBV DSlO株)单克隆抗体制备、纯化及性质
I、嗜肾型IBV DSlO株
本发明中使用的嗜肾型IBV DSlO株的保藏信息如下生物材料(毒株)Ck/Jiangsu/DS10/2008 分类命名鸡传染性支气管炎病毒；
拉丁文学名！Infectious Bronchitis Virus (IBV);
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏日期2010年6月25日；
保藏编号CGMCC No. 3957。注本文中为了方便表述，将保藏编号为CGMCC No. 3957的毒株缩写为嗜肾型IBV DSlO 株。2.嗜肾型IBV DSlO株的繁殖、纯化
取嗜肾型IBV DSlO毒种，接种于11日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司种蛋，本实验室孵化)尿囊腔内，接种量为0.1 mL /胚，置37°C培养。弃去24小时内死亡的胚。培养35小时后，收获死胚及未死胚，置4°C冷冻至全部胚死亡后，收集死胚尿囊液。收获的尿囊液在4700Xg、4°C条件下离心20 min，取上清液；再以14000Xg、4°C条件离心15 min,留取上清液；再将上步中获得的上清液在54000Xg、4°C条件下离心I. 5h，弃上清，在沉淀中加入适量TEN缓冲液，并用无菌滴管吹打沉淀使其分散、溶解成悬浊液，即为嗜肾型IBV DSlO株的纯化抗原(浓度为20.84 mg/mL)，添加P -丙内酯(终浓度0. 5%。)4°C灭活24 h后作为嗜肾型IBV DSlO株灭活纯化抗原(简称灭活纯化抗原)，-70°C保存备用。3.小鼠免疫
用嗜肾型IBV DSlO株的灭活纯化抗原免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学实验动物中心)，共免疫4次。首次免疫，用灭活纯化抗原加等体积弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)的乳化液，免疫剂量为200 UL/只；第二、三次免疫，均用灭活纯化抗原加等体积的弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)的乳化液，免疫剂量为100 u L/只(第一、二、三次免疫之间间隔14天)；第三次免疫后7天，尾静脉采血分离血清，用微量血凝抑制(HI)实验(钱晓佳等.鸡传染性支气管炎病毒(M41) HI抗原的制备与初步应用[J].安徽农业科学，2007，35(30) =9545-9546,954.)检测血清抗体水平，选取血清抗体效价最高的小鼠采用灭活纯化抗原从尾静脉注射加强免疫(即第4次免疫)，免疫剂量为50 U L/只。获得嗜肾型IBV DSlO灭活纯化抗原对BALB/c小鼠三免后的血清HI效价达到1:256，该血清分装后_20°C保存，作为阳性参考血清备用。4、按照常规方法制备饲养细胞
5、细胞融合细胞融合按照常规方法(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第一版)[M].合肥安徽科技技术出版社，1994: 18-30.)进行。取本实施例标题3中进行第4次免疫三天后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC，北京中原合聚经贸有限公司)按5:1的比例混匀于50 mL刻度离心管，用20-30 mL的DMEM基础培养基(购自Sigma公司)洗涤2次，然后在1000 rpm、10 min条件下离心，弃上清，用手掌轻击管底，使沉淀细胞松散均匀；将此融合管移入37°C水浴中预热并轻轻旋转，在60 s内将I mL预热至37°C的50% PEG-4000(购自南京生兴生物科技公司)沿管壁滴加到融合管中的沉淀细胞上；在5 min内将25 mL预热至37°C的DMEM基础培养基沿管壁滴加到融合管中；然后将融合管在37°C静置10 min,在1000 rpm下离心5 min，弃上清，加入50 mL含HAT (Sigma公司，H0262)的DMEM培养基重悬细胞；按每孔0. ImL加入已经培养有饲养细胞(见实施例二步骤2)的96孔培养板中，置37°C、5%的CO2培养箱中培养。5天后观察细胞生长状况，并用新鲜的含HAT的DMEM培养基换出培养板孔中1/2培养基；10天后，用含HT (Sigma公司，H0137)的DMEM培养基换出原含HAT的培养基；观察融合细胞生长情况，待其分布至孔底面积1/5以上时，吸出细胞培养上清液进行抗体检测。6、杂交瘤细胞的筛选
通过检测各融合细胞培养上清液中的抗体来筛选杂交瘤细胞。当检测孔为阳性时，说明该孔的杂交瘤细胞分泌抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体。采用如下方法检测融合细胞培养上清液中的抗体(间接ELISA检测)取灭活纯化抗原用碳酸盐缓冲液以体积比1:200稀释，在96孔细胞板中每孔加入100 U L稀释后的灭活纯化抗原，4°C包被过夜；弃去液体，用PBST缓冲液洗涤三次，5 min/次，最后用吸水纸拍干；用1% BSA-PBST, 100 UL /孔，37°C封闭I h ;再用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；将细胞培养上清液(本实施例标题5获得)、用0. 5% BSA-PBST按照1:100倍稀释的阴性参考血清(将一只约8周龄未免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血分离的血清)和阳性参考血清加入相应孔内(第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照)，100 u L/孔，371作用1.5 h后，弃去液体用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入用0. 5% BSA-PBST按1:3500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(购自北京金杉生物科技有限公司)，100 UL/孔，37°C作用I h后，弃去液体，用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液(Biosharp公司，TMB-S-002，)，100 y L/孔，37°C避光显色10 min后加入终止液(2 mol/L的H2SO4)终止反应；酶标仪测定OD■值。以空白对照调零，P为各孔的OD■值，N为加入阴性参考血清的孔的OD■值。当NS 0.1，加入阳性参考血清的孔的OD45tl值与加入阴性参考血清的孔的OD■值的比值(P/N)彡2. 1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N彡2. I的检测孔判为阳性，I. 5彡P/N < 2. I的检测孔判为可疑，P/N < I. 5的检测孔判为阴性。7、杂交瘤细胞的亚克隆
将本实施例标题6中筛选所获得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第一版)[M].合肥安徽科学技术出版社，1994 35-36)进行亚克隆。挑选阳性孔，采用有限稀释法连续进行2_3次的亚克�。钡窖强寺『笏邢赴咨锨寮觳饩粜裕腋骺准觳獾腛D值比较接近，将多次亚克隆后的阳性孔细胞株扩大培养后冻存。获得能稳定分泌抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4。杂交瘤细胞株2G4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院，其保藏号为CGMCC No. 6172，保藏日期为2012年5月28日，分类命名为分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体的杂交瘤细胞。8.抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体的制备
取7 8周龄健康BALB/c母鼠(购自扬州大学实验动物中心)，腹腔注射液体石蜡 (0. 5ml/只)一周后，将杂交瘤细胞株2G4以PBS缓冲液稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射0. 2mL，约含I 2X IO6个杂交瘤细胞。7-10天后当小鼠腹部明显膨大时采集腹水。将采集的腹水在4000 rpm条件下离心5分钟，弃去油脂与沉淀后，所得上清液即为初步纯化的腹水。将初步纯化的腹水小量分装，于-70°C保存备用。利用HiTrap Protein G 亲和层析柱(Pharmacia 公司产品，货号17-0404-01)纯化抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体。初步纯化的腹水中加入3倍体积的结合缓冲液(Protein G IgG binding buffer, pH5. 0, Thermo Scientific 公司产品，货号:21019)稀释，然后取该混合液用I mL/min的上样流速注入到层析柱中；吸取10 mL结合缓冲液以
2mL/min的流速加入层析柱中，洗脱杂蛋白；用5 mL洗脱缓冲液(IgG elution buffer,pH2. 8, Thermo Scientific公司产品，货号:21004)以I mL/min的上样流速洗柱,用离心管收集抗嗜肾型IBV DSlO单克隆抗体的洗脱峰(离心管内预先加入pH9. O、浓度为I M的Tris-Hcl缓冲液)。将抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体的洗脱峰做SDS-PAGE电泳(见图I结果显示，未纯化的腹水杂蛋白较多，经亲和层析除杂后仅有重链和轻链两条蛋白带。所述抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体的洗脱峰即为抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体溶液，其蛋白含量为944 U g/mL，置-20°C保存备用。9.抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体腹水效价的测定及亚类鉴定
将初步纯化的腹水用PBS缓冲液以2倍倍比稀释，将各浓度的腹水加入到封闭好的包被有灭活纯化抗原(用碳酸盐缓冲液以1:200稀释)的96孔酶标板孔中(第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照)，100 y L/孔，37°C，孵育90 min ;用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入1:3500稀释HRP标记的羊抗鼠IgG (购自北京金杉生物科技有限公司)，100 UL/孔，37°C作用I h，PBST洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液(Biosharp公司，TMB-S-002), 100 u L/孔，37°C避光显色10 min后加入终止液(2mol/L H2SO4)终止反应；经酶标仪测定0D450nm值。以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为加入阴性参考血清的孔的OD45tl值。当N < 0. 1，加入阳性参考血清的孔的OD450值与N的比值(P/N)彡2. 1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N彡2. I的检测孔判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体腹水间接ELISA效价为1:102000。采用鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Sigma公司，IS02-1KT)对抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体进行亚类鉴定，实验步骤按照试剂盒操作说明进行，结果表明杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体属于IgGl亚类。10.抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体与嗜肾型IBV DSlO株的反应原性与特异性鉴定
用Western-blotting (J.萨姆布鲁克，D. W.拉赛尔.分子克隆实验指南[M].第三版北京科学出版社，1998,884-895.)鉴定杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体的反应原性与特异性。嗜肾型IBV DSlO株尿囊液、阴性尿囊液(无菌采集自4°C致死的12日龄SPF鸡胚)经5%浓缩胶和10%分离胶中进行SDS-PAGE电泳分离后，以
2mA/cm2,90 min，转移至PVDF膜上，用10% BSA (购自Sigma公司)溶液4°C封闭2 h ;用PBST缓冲液洗膜3次，5 min/次；以抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体为一抗，以1:2500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG (购自北京金杉生物科技有限公司)为二抗；用增强型DAB显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)显色。结果显示，该单克隆抗体可以与嗜肾型IBV DSlO株特异性结合，在14 KDa左右处有单一一条反应条带，而不与阴性尿囊液反应，证明该抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体是嗜肾型IBV DSlO株的特异性抗体。用碳酸盐缓冲液将含禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) H9亚型、鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、鸡减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus, EDSV)、鸡新城疫病毒(New Castle Disease Virus, NDV)、嗜肾型 IBVDSlO株的SPF鸡胚尿囊液、阴性尿囊液I 200稀释后按本施例标题6的方法包被96孔酶标板，以杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体为一抗，同时设PBS缓冲液阴性对照进行间接ELISA实验(参见本实施例标题6方法)，结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体仅与嗜肾型IBV DSlO株尿囊液毒成强阳性反应，与阴性对照和其它鸡病毒尿囊液均为阴性反应，表明杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBVDSlO株单克隆抗体具有很好的特异性。其中禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) H9亚型,购自南京天邦生物科技有限公司。鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、鸡减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus, EDSV)和鸡新城疫病毒(New Castle Disease Virus,NDV)购自中国兽医药品监察所。实施例二标准IBV抗体阳性血清、阴性血清的制备
本发明制备了标准IBV抗体阳性血清、阴性血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。(I)标准IBV抗体阳性血清配制嗜肾型IBV DSlO株灭活油乳剂疫苗(农业部兽药评审中心组等.兽用生物制品质量标准汇编(2010) [M].北京中国农业出版社，2011:69-73)，免疫SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司种蛋，本实验室孵化饲养)，制备标准IBV抗体阳性血清。具体方法为SPF鸡在隔离环境中饲养至14日龄，用嗜肾型IBV DSlO株灭活油乳剂疫苗颈部皮下注射0.3 mL/只免疫；21天后用同样的方法进行二次免疫；14天后，采集鸡翅静脉血，分离血清，并用微量血凝抑制(HI)试验(钱晓佳等.鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J].安徽农业科学，2007，35 (30)9545-9546,954.)检测其血凝抑制效价，次日选取血清抗体效价彡81og2的SPF鸡从心脏采血分离血清作为标准IBV抗体阳性血清，以0. 5mL/瓶的量分装于无菌玻璃瓶中，密封，-20°C保存。(2)标准IBV抗体阴性血清取I周龄SPF鸡，心脏采血，分离血清作为标准IBV抗体阴性血清，以0. 5 mL/瓶的量分装于无菌玻璃瓶中，密封，-20°C保存。
实施例三检测嗜肾型IBV抗体(或抗原)的间接ELISA方法的建立及其标准化为了建立检测嗜肾型IBV抗体(或抗原)的间接ELISA试剂盒，对嗜肾型IBV抗体(或抗
原)的间接ELISA检测方法进行了如下的条件优化
(I)方阵实验确定抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体的最适包被浓度及血清最佳稀释度采用方阵滴定法(丘德新等.间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J].中国兽医学报，2002,22 (3) :149-151)确定抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体，标准阳性、阴性血清的最佳工作浓度。取96孔酶标板，将抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体溶液(实施例一标题8制备)用碳酸盐缓冲液从1:100倍比稀释至1:12800后，自左向右每个稀释度加一列，100U L/孔；同时设置两个空白对照孔，每孔加100 U L碳酸盐缓冲液，4°C包被过夜。取出拍干后，以PBST缓冲液洗涤3次(5 min/次)，拍干液体。用1% BSA-PBST, 100 u L /孔，37°C封闭I h，洗涤同前。再加入用0. 5% BSA-PBST按1:200稀释的嗜肾型IBV DSlO株灭活纯化抗原(实施例一标题2制备)，100 u I/孔，37°C孵育I. 5 h，洗涤同前。将标准IBV抗体阳性血清(缩写为标准阳性血清)和标准IBV抗体阴性血清(缩写为标准阴性血清)分别用0. 5% BSA-PBST从1:100倍比稀释至1:12800后，每个稀释度加一行，100 u L/孔，37。。孵育I h，洗涤同前。每孔中加入100 uL 1:35000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG (Jackson公司产品，货号93038)，37°C孵育I h，再用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次。继而每孔中加入100 y L底物显色液(Biosharp公司产品TMB-S_002)，37°C避光显色10 min，最后加A 50 UL浓度为2 11的％504终止反应。在酶标仪上读取OD45tl吸光值。以标准阳性血清OD45tl值接近1.0，标准阳性血清OD45tl/标准阴性血清OD45tl (P/N)的比值最大，且阴性血清OD450值在0. I左右所在孔的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体浓度和血清稀释液作为最佳单抗工作浓度和血清稀释度。从表I中的结果可知，用于包被的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体溶液的浓度可以为0. 59 9. 44 u g/mL，标准阳性、阴性血清的稀释度为1:100 400。用于包被的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体溶液的浓度优选为2.36 y g/mL (实施例一标题8制备的抗嗜肾型IBV DSlO株单克隆抗体溶液1:400稀释)，标准阳性、阴性血清的稀释度优选为1:200。表I单抗和血清的最佳稀释度选择结果(OD45tl值)权利要求
1.一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原的酶标板。
2.根据权利要求I所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于采用如下方法制备所述酶标板 Ca)向酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为0. 59 9. 44 u g/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液，4°C包被过夜； (b)洗涤； (C)用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤； Cd)向酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为104. 2 208. 4 u g/mL的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原溶液，37°C孵育1.5 h，洗涤。
3.根据权利要求2所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于步骤(a)中所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液的浓度为2. 36 u g/mL。
4.根据权利要求2所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于步骤(d)中所述加入到酶标板每孔中的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株灭活纯化抗原溶液的浓度为138. 90 u g/mL。
5.根据权利要求4所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括 (1)IOX洗涤液pH7.4，体积100mL ;所述IOX洗涤液是含有质量浓度分别为5%Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液； (2)10X血清稀释液pH7.4，体积100 mL ;所述IOX血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液； (3)酶标试剂辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL ； (4)底物显色液，包括 A液将I mL浓度为10 mg/mL的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液加入到100 mL浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液的配制方法为0. I mol/L磷酸二氢钠水溶液87. 7 mL和0. I mol/L磷酸氢二钠水溶液12. 3 mL混合即成； B液体积浓度为3%的H2O2水溶液，10 mL ； (5)终止液2 mol/L 的 H2SO4 溶液 100 mL ； (6)标准阳性血清即标准IBV抗体阳性血清,0.5 mL ； (7)标准阴性血清即标准IBV抗体阴性血清，0.5 mL。
6.一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体的酶标板。
7.根据权利要求6所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述酶标板的制备方法如下Ca)在酶标板的每孔中分别加入100 u L浓度为0. 59 9. 44 y g/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液，4°C包被过夜； (b)洗涤； (C)用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。
8.根据权利要求7所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DSlO株单克隆抗体溶液浓度为2. 36 V- g/mLo
9.根据权利要求8所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括 (1)IOX洗涤液pH7. 4，体积100 mL ;所述IOX洗涤液是含有质量浓度分别为5%Tween-20,8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液，； (2)10X血清稀释液pH7.4，体积100 mL ;所述IOX血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0. 2%氯化钾、2. 9%磷酸氢二钠和0. 2%磷酸二氢钾的水溶液，； (3)酶标试剂辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25mL ； (4)底物显色液，包括 A液将I mL浓度为10 mg/mL的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液加入到100 mL浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0. I mol/L、pH为6. 0的磷酸缓冲液的配制方法为0. I mol/L磷酸二氢钠水溶液87. 7 mL和0. I mol/L磷酸氢二钠水溶液12. 3 mL混合即成； B液体积浓度为3%的H2O2水溶液10 mL ； (5)终止液2mol/L 的 H2SO4 溶液，100 mL ； (6)标准阳性血清即标准IBV抗体阳性血清,0.5 mL ； (7)标准抗原嗜肾型IBVDSlO株灭活纯化抗原，I mL ； (8)阴性标准品对照13日龄SPF鸡胚尿囊液，ImL。
全文摘要
本发明提供检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒，属于生物技术领域。所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株灭活纯化抗原的酶标板。所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的酶标板。本发明为检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫抗体。
文档编号G01N33/543GK102721812SQ201210204910
公开日2012年10月10日申请日期2012年6月20日优先权日2012年6月20日
发明者侯继波, 唐应华, 杨维维, 陆吉虎, 高峰申请人:江苏省农业科学院

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检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒的制作方法