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专利名称：一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抗体，尤其涉及一种鱼类主要过敏原小清蛋白荧光标记抗体、制备方法及其用途。
背景技术：
鱼类由于含有丰富的不饱和脂肪酸和脂溶性维生素，是人类重要的食物来源。但是，鱼类同时也是八大类致敏食物之一，在沿海国家因食用鱼类导致过敏的事件时有发生。鱼类中的主要过敏原之一是小清蛋白，如何快速、准确、安全的进行过敏原小清蛋白的检测就越发显得重要
发明内容

本发明要解决的技术问题是提供ー种快速、准确、安全的检测鱼类小清蛋白的荧光标记抗体。为实现上述目的，本发明提供一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体，具体为藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体组合而成。其中的藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体均分别进行了处理；藻红蛋白通过SPDP处理；鱼小清蛋白单克隆抗体通过2-IT处理。所述的鱼类小清蛋白荧光标记抗体制备方法包括如下步骤
藻红蛋白的处理藻红蛋白与SPDP进行混合后,恒温摇床100 rpm/min，25°C避光反应45 min,过脱盐柱去除多余SPDP,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心；藻红蛋白与SPDP的摩尔比为1:80 ；
鱼小清蛋白单克隆抗体的处理鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT进行混合后，恒温摇床100 rpm/min, 25°C避光反应45 min,过脱盐柱去除多余的2-IT,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心；鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT的摩尔比为1:100 ;
藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应将处理后的藻红蛋白与处理后的鱼小清蛋白单克隆抗体在一定温度下避光反应；反应条件为25°C下避光反应16 h ；
收集将反应后的样品上样于高效液相色谱，根据分子量收集标记部分。本发明还包括由上述方法制备得到的鱼类小清蛋白荧光标记抗体。鱼小清蛋白单克隆抗体优选为抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体。本发明还提供了鱼类小清蛋白荧光标记抗体的用途，优选为检测鱼类小清蛋白的用途，更优选为检测鲢鱼小清蛋白的用途。本发明的鱼类小清蛋白荧光标记抗体的制备过程为SPDP (3- (2-吡啶ニ巯基)丙酸N-羧基琥珀酰亚胺酷)(21857，Thermo)与藻红蛋白的反应，2-IT (2-亚氨基四氢噻吩)(26101，Thermo)与抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体反应，再两者混合反应得到。本发明的鱼类小清蛋白荧光标记抗体既能实现对小清蛋白的快速检测，又可用于免疫突光检测、Western blot等分析。本发明所述的鱼类，不仅包括淡水鱼，也包括海水鱼。比如鲢鱼、鲫鱼、鲤鱼、罗非鱼、草鱼、巴浪鱼、鲷鱼、鳗鱼、鲆鱼等。采用本发明的鱼类小清蛋白荧光标记抗体进行鱼类小清蛋白的检测的主要优势
1、相对于传统化学发光检测，这种方法更安全。传统的化学发光有用DAB(ニ氨基联苯胺)和ECL (底物化学发光)显色的，但是所用的试剂会有一定毒性；而利用荧光标记检測，利用了藻红蛋白的天然荧光和无毒性的特点，避免了显色过程中带来的不安全因素；
2、与其他检测方法，这种方法大大缩短了检测的时间。藻红蛋白标记ー抗检测，与传统方法相比较，因其不需要ニ抗反应和显色，大大缩短了检测的时间，提高了效率；
3、与传统的检测方法比较，该荧光标记抗体有利于提高检测的特异性。藻红蛋白标记ー抗与抗原反应后，直接在荧光成像仪上记录结果，可直接避免由ニ抗带来的非特异性反应。


图I为应用鲢鱼小清蛋白突光标记抗体采用Dot blot法检测不同浓度的鲢鱼小
清蛋白。图2为应用鲢鱼小清蛋白突光标记抗体通过Western blot检测不同浓度的鲢鱼
小清蛋白。图3为应用鲢鱼小清蛋白荧光标记抗体与鲢鱼小清蛋白的免疫荧光检测试验。图4为应用鲢鱼小清蛋白突光标记抗体与鲢鱼小清蛋白的Western blot试验。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :鲢鱼小清蛋白荧光标记抗体的制备。I、鲢鱼小清蛋白的纯化
(1)小清蛋白粗提物的制备将20g鲢鱼白色肉于4倍体积20 mmol/L Tris-HCKpH7. 5)缓冲液中组织捣碎，8000 g离心30 min后即得小清蛋白粗提物；
(2)硫酸铵盐析将小清蛋白粗提物86ml进行60 %硫酸铵盐析，即将31. 05 g硫酸铵加入粗提物中搅拌60 min后，静置2 h，于15000 g离心30 min。取上清95 ml，加入26. 51g硫酸铵搅拌60 min后,静置2 h,于15000 g离心30 min。取沉淀溶解于10 ml 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)，并于该缓冲液中透析16 h;
(3)离子交換柱层析将透析后的样品上样于预先用20mmol/L Tris-HCKpH 7. 5)平衡的DEAE-Sepharose离子交换柱,DEAE-Sepharose离子交换柱洗脱时,洗脱液为20 mmol/L Tris-HCl缓冲液,流速lml/min。收集未吸附部分较纯的目的蛋白进行超滤浓缩；
(4)凝胶过滤柱层析将浓缩后的样品上样于S^hacrylS-200凝胶过滤柱层析，SP得纯化的鲢鱼小清蛋白。2、抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备选择5只雌性、6 8周龄的BALB/c小鼠(厦门大学抗癌中心)，将实施例I纯化的鲢鱼小清蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)混匀，进行腹腔注射，剂量为每只小鼠IOOyg抗原；之后每隔2周以相同剂量的抗原进行腹腔注射，加强免疫；在细胞融合前4天，选抗体滴度最高的小鼠进行强化免疫I次；
分离强化免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞，将其与SP2/0骨髄瘤细胞(中国科学院细胞库)在聚こニ醇(Sigma)的介导下进行融合；将融合后的细胞在含有20 %胎牛血清(Invitrogen)和 I % HAT (Sigma)的 RPMI 1640 (Invitrogen)培养基上，于 37 t5C 进行培养；杂交瘤细胞通过ELISA法进行筛选。筛选出的阳性细胞采用有限稀释法进行克隆化培养，该操作重复3次以保证筛选出能分泌抗小清蛋白抗体的单克隆阳性细胞株，筛选的阳性细胞株保存于液氮中；
筛选的能分泌抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，同时以液体石蜡对BALB/c小鼠进行腹腔注射(剂量O. 5 ml/只)，以敏化小鼠；1 2周后将杂交瘤细胞对敏化的小鼠进行腹腔注射(IO6个/只);在腹水尽可能多，小鼠濒临死亡前(I 2周)，用 注射器收获腹水；将腹水混合后，在56 °C热灭活45 min, 1500 g离心10 min取上清即得抗小清蛋白单克隆抗体；
将得到的单克隆抗体离心过滤，与平衡缓冲液(20 mmol/L的PBS，pH 7. O)混合后，上样于预先用 20 mmol/L 的 PBS (pH 7. O)平衡的 Protein G Sepharose (AmershamBiosciences);用平衡缓冲液流洗至 A28tlnm 为基线后，以 O. I mol/L glycine-HCl (pH 2. 7)进行洗脱至A28tlnm为基线；收集各部分样品进行SDS-PAGE电泳分析，即可得到纯化的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体。3、鲢鱼小清蛋白荧光标记抗体的制备
藻红蛋白的处理300ul藻红蛋白(2. 36 mg/ml)(制备方法见专利申请号201010170963. 8，红毛藻藻红蛋白分离纯化的方法，
公开日为2011年11月16日)与11.8ulSPDP (20 mmol/L)的比例为1:80 (摩尔比)，进行混合；恒温摇床(F0RMA420，Thermo) 100rpm/min, 25°C避光反应45 min,过脱盐柱去除多余SPDP,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心；
抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的处理150ul抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体(4mg/ml)与26. 8ul 2-IT(14 mmol/L)的比例为 1:100 的条件，在摇床为 100 rpm/min，25°C反应 45min,过脱盐柱去除多余的2-IT,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心；
藻红蛋白与抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应将处理后的藻红蛋白与处理后的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体在25°C避光反应16 h ；
收集将反应后的样品过高效液相色谱，根据分子量收集标记部分(400 kDa)。实施例2 :应用鲢鱼小清蛋白荧光标记抗体采用Dot blot法检测不同浓度的鲢鱼小清蛋白
结果见图I。图I为采用Dot-blot法检测小清蛋白，1-9小清蛋白的浓度分别为0.5mg/ml, 0. 25 mg/ml, 125 μ g/ml, 62. 5 μ g/ml, 31. 25 μ g/ml, 15. 625 μ g/ml, 7. 8 μ g/ml, 3. 9 μ g/ml, I. 95 μ g/ml。可以检测到的蛋白灵敏度为15. 625 μ g/ml。实施例3 :应用鲢鱼小清蛋白突光标记抗体通过Western blot检测不同浓度的鲢鱼小清蛋白。结果见图2。图2为标记物通过Western-blot检测不同浓度的小清蛋白，1-9 泳道小清蛋白浓度分别为 O. 5mg/ml, O. 25mg/ml, 125 μ g/ml, 62. 5 μ g/ml,31. 25 μ g/ml, 15. 625 μ g/ml, 7. 8 μ g/ml, 3. 9 μ g/ml, I. 95 μ g/ml，上样量均为 10 ul。检测灵敏度为15. 625 μ g/ml。实施例4 :应用鲢鱼小清蛋白荧光标记抗体与鲢鱼小清蛋白的免疫荧光检测试验
1)点样将O. 5mg/ml的2ul鲢鱼小清蛋白点在硝酸纤维膜上，等样品完全被膜吸收；
2)封闭加5%脱脂奶于摇床上室温封闭I h ；
3)一抗孵育倒掉封闭液，用TBST漂洗膜5X5 min，加ー抗(小清蛋白标记藻红蛋白抗体)于室温下孵育2 h或4 ° C过夜；
4)显色将孵育后的一抗回收，用TBST漂洗膜5X5min，化学发光荧光和可见光凝胶成像仪，Green blot路径下，曝光时间为200 ms。结果见图3。从图中可以看出，检测得到的荧光强度很高，表明采用Dot-blot方法，利用制备的鱼类小清蛋白荧光标记抗体可以方便地检测鱼类小清蛋白。实施例5 :应用鲢鱼小清蛋白突光标记抗体与鲢鱼小清蛋白的Western blot试验
1)电泳lmg/ml的鲢鱼小清蛋白2倍稀释后，上样15% SDS-PAGE胶，上样量为10ul，电泳结束后，裁下胶分子量在10-14 kDa的蛋白条带，浸泡在蛋白转移液中；
2)转膜将硝酸纤维素膜及滤纸浸于蛋白质转移缓冲液中。阳极开始按三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤 纸的顺序叠放，用滚轮小心赶走气泡，上下滤纸之间不能接触，以免短路，接上电源转膜25min ；
3)初染转膜结束后取出硝酸纤维素膜，用丽春红进行初染，出现目的蛋白条带后，回收丽春红，并用TBST漂洗3 X 5 min ;
4)封闭加5%脱脂奶于摇床上室温封闭1-2 h ；
5)一抗孵育倒掉封闭液，用TBST漂洗膜5X5 min，加ー抗(小清蛋白标记藻红蛋白抗体)于室温下孵育2 h或4 ° C过夜；
6)显色将孵育后的一抗回收，用TBST漂洗膜5X5min，化学发光荧光和可见光凝胶成像仪，Green blot路径下，曝光时间为200 ms。结果见图4。浓度为lmg/ml，上样量为10μ I。从图中可以看出，藻红蛋白标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体可以检测到的条带非常亮，表明该抗体适用于Western blot检测相应的抗原。
权利要求
1.一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体组合而成。
2.权利要求I的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体均分别进行了处理；其中藻红蛋白通过SPDP处理；鱼小清蛋白单克隆抗体通过2-IT处理；优选鱼小清蛋白单克隆抗体为抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体。
3.权利要求I的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，制备方法包括如下步骤 藻红蛋白的处理藻红蛋白与SPDP进行混合后，恒温摇床100 rpm/min, 25°C反应45min,过脱盐柱去除多余SPDP,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心； 鱼小清蛋白单克隆抗体的处理鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT进行混合后，摇床100rpm/min, 25°C反应45 min,过脱盐柱去除多余的2-IT,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心； 藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应将处理后的藻红蛋白与处理后的鱼小清蛋白单克隆抗体在一定温度下避光反应； 收集将反应后的样品上样于高效液相色谱，根据分子量收集标记部分。
4.权利要求2的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，藻红蛋白与SPDP的摩尔比为 1:80。
5.权利要求2的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT的摩尔比为1:100。
6.权利要求2的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，藻红蛋白和鱼小清蛋白单克隆抗体的处理中恒温摇床条件均为100 rpm/min, 25°C避光反应45 min。
7.权利要求2的鱼类小清蛋白荧光标记抗体，其特征在于，藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应中，反应条件为25°C避光反应16 h。
8.权利要求I一 7项任一所述的鱼类小清蛋白荧光标记抗体的制备方法，其步骤为 藻红蛋白的处理藻红蛋白与SPDP进行混合后，恒温摇床反应，过脱盐柱去除多余SF1DP,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心； 鱼小清蛋白单克隆抗体的处理鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT进行混合后，摇床100rpm/min, 25°C反应45 min,过脱盐柱去除多余的2-IT,用Millipore 10 kDa的超滤浓缩管离心； 藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应将处理后的藻红蛋白与处理后的单克隆抗体在一定温度下避光反应； 收集将反应后的样品上样于高效液相色谱，根据分子量收集标记部分。
9.权利要求8的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白与SPDP的摩尔比为1:80; 鱼小清蛋白单克隆抗体与2-IT的摩尔比为1:100 ; 藻红蛋白的处理中恒温摇床条件为100 rpm/min, 25°C避光反应45 min ； 鱼小清蛋白单克隆抗体的处理中摇床反应条件100 rpm/min, 25°C反应45 min ； 藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应中，反应条件为25°C避光反应16 h ； 鱼小清蛋白单克隆抗体优选为抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体。
10.权利要求I一 7任一项所述的鱼类小清蛋白荧光标记抗体的用途，优选为检测鱼类小清蛋白的用途，更优选为检测鲢鱼小清蛋白的用途。
全文摘要
本发明涉及一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体、制备方法及其用途。该抗体由藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体组合而成，藻红蛋白通过SPDP进行了处理；单克隆抗体通过2-IT进行了处理。鱼类小清蛋白荧光标记抗体的制备方法包括藻红蛋白的处理；鱼小清蛋白单克隆抗体的处理；藻红蛋白与鱼小清蛋白单克隆抗体的混合反应；收集标记产物。还提供了一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体在检测鱼类小清蛋白中的应用，该检测方法快速，准确、安全。
文档编号G01N33/533GK102680674SQ20121015342
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者刘光明, 曹敏杰, 沈建东, 苏文金, 蔡秋凤 申请人:集美大学