专利名称：用于成像式荧光显微术的显微镜及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲式光源和成像探测器。此外，本发明还涉及一种特别是应用本发明的显微镜的相应方法。本发明总体涉及荧光显微术，其中特别是涉及宽视野荧光显微术。
背景技术：
宽视野荧光显微术在生物和医学研究中具有重大意义。在传统的荧光显微术中试样或多或少经逐点照射，而在所谓的宽视野显微术(widefiled-microscopy)中所述试样经大面积照射，并用物镜成像，以致该整个系统的PSF(点扩展函数，Point SpreadFunction)仅由物镜的(探测)PSF决定。与此相反，在共聚焦显微镜中入射光聚焦在试样 上，以致该总PSF是照射PSF和探测PSF的乘积。较之在具有空间滤光片的共聚焦显微镜中通过探测针孔所能实现的，原则上，在宽视野荧光显微镜中有明显更多的激发光从试样反散射进显微镜的探测器的光径。然而为了能够在令人满意的条件下摄取图像，必须充分抑制散射光/反射光。为此，在宽视野荧光显微镜中通常使用抑制该相应激发波长的吸收滤光片。这通常借助于滤光立方体实现，所述滤光立方体除包含吸收滤光片(发射滤光片)外还包含用于激发光的光谱纯化的激发滤光片和作为主分光片的二向色镜，其中所述主分光片同时有助于激发滤光片和发射滤光片。但对此的缺点是，由于不变的滤光片特性，激发光的光谱调谐是不可能的。此外，在多波长激发时，必需使用在合适的光谱位置上进行透射或反射的完全特定的滤光片，这进一步限制了滤光片的灵活性，并在许多可能的光谱激发范围和探测范围里需要进行大量的滤光片组合，以至于这是不可能通过在实践中常用的滤光片轮实现的。此外，各滤光片的光谱宽度还有所制约，即该探测范围距激发波长范围必然有一定的光谱间距，从而在中间范围损失了探测光，对于显微镜更高的灵敏度来说，该探测光是应该可以探测到的。对共聚焦显微镜可示例性地参阅文献DE 199 06 757 Al。其中该探测光通常至少部分作为被校准的光束而穿过针孔。相应地可使用声光部件。与此相反，在宽视野显微镜中，在视野镜组中存在真实图像，这表明光在许多可能的空间角度中同时入射，这使得相应的声光部件的使用似乎反而没什么意义，甚至完全不可能。这归因于所述声光部件需要极大的光孔，因此会特别复杂且昂贵。在文献US 5252834中公开了显微镜中的门控制,但不用于成像和完全不适用成像中的反射光抑制/散射光抑制。但其中涉及逐点光谱摄像试样的化学组成的特性测定(显微分光光度术)。其中未提供成像探测器。
发明内容
本发明的目的在于，在适用于宽视野荧光显微术的成像式荧光显微镜中，利用简单的装置实现反射光抑制/散射光抑制，用以因此在令人满意的条件下摄取可再现的图像。对此所需的措施应可用简单的装置成本低廉地实现。上述关于本发明的显微镜的目的是通过权利要求I的特征部分实现的。上述关于本发明的方法的目的是通过从属权利要求18的特征部分实现的，更确切地说是利用本发明的显微镜。关于本发明的显微镜，其基本目的是如此实现的，即设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源和探测器的同步以达到反射光抑制/散射光抑制的目的，从而对适宜于处理的荧光成分加以利用，而对不适宜的成分予以舍弃。本发明的方法是相应地为此设计的。本发明的方法提出对显微镜中的成像探测器结合脉冲光源进行门控制。然而目前在显微术中主要使用的照相机不允许进行门控制，甚至不对所有像素同时进行，因为通常是通过共同的读取寄存器进行按序读取。通常也不允许使用具有单光子灵敏度的CMOS芯片，因为尽管可以利用其进行并行读�。枚寥」淘谘荌OOns范围内对适用的门控制 来说实在是太慢了。基于本发明，优选将以盖革模式运行的雪崩光电二极管的阵列(APD阵列；其中这种APD有时也被称为“硅光电倍增管”)用于成像设备，所述成像设备允许进行门控制的，并可借助它实现本发明的反射光抑制/散射光抑制。原则上也可以考虑其它适于“可门控制的照相机”的可能性。本发明基于利用脉冲光源和成像探测器进行工作的荧光显微镜。考虑到荧光的衰变时间，当脉冲光源所具有的脉冲宽度在荧光团的寿命范围内或更好地低于此范围时，对于脉冲光源是有利的。基于通常的荧光染料，脉冲宽度在5ns范围内，优选在Ins范围内，更优选在200ps范围内是有利的。光源可以是激光器、LED、闪光LED或可被激发激光的放大介质等。如果该光源可触发则更是特别有利的，其中这一点对于本发明技术方案的实施不是必不可少的。在特别有利的方式中，可应用脉冲式白光激光器、脉冲式LED、脉冲式OPO和其它脉冲式激光器。使用可门控制的成像探测器，换言之“可门控制的照相机”进行探测。其可以是预接具有经某种改制的可触发的/可门控制的光学快速快门的照相机，或是可门控制地激活/去活的成像探测器。也可利用在产生探测信号后提供相应信息的成像探测器，该信息表明是否应处理或弃去相应的信号成分。可门控制的光学快门可以是例如可快速控制的光学图像放大器，所述图像放大器在关闭状态下不增强光，而在接通状态下增强光；也可以是可饱和的光学吸收器，所述光学吸收器通过短的光脉冲而饱和，并由此在施加门控制时变成透明的。可门控制的探测器可基于以盖革模式运行的雪崩光电二极管(APD)中的阵列实现。为此，该成像探测器的每个单个像素均由单个以盖革模式运行的APD阵列组成或由其中多个阵列组成(=子阵)。通过施加合适的门电压开启单个APD的盖革模式，由此实现入射光子能够触发对APD的击穿，并产生相应的电子信号。只要门控制关闭，该状态就不会发生，以致此时该探测器是去活的。也可考虑门控制的其它实现可能方式，例如与此相反的，所述探测器的输出端在门控制的断开时间中短路或针对信号支路中断。类似的可由外部控制的门控制也可在其它的照相机类型如CMOS芯片或CXD芯片中实现。原则上不一定需要在门控制断开状态下抑制信号的产生。“保存”相应的时间信息就足够了。在极端情况下，对每个单个光子赋以时间标记，即对每个单个光子的到达时间予以存储就足够了，用以在下游的数据处理设备(现场可编程序门列阵(FPGA)、数字信号处理设备(DSP)及其他)中判定是否应处理该光子或舍弃该光子。这并不是对每个单个光子所必须进行的。原则上对每个像素录下时间信号分布或其一部分，并随后加以处理就足够了。前述所讨论的技术之间的转换方式不是一成不变的，特别是由于当今日益增强的集成电子技术。重要的是，该成像设备是可门控制的，其中对所有像素优选存在一致的(同时的)门控制，尽管在特定情况下，也可考虑不同的时间门位置(temporal gatepositions)。富于独创性的关键的一步在于，该可门控制的成像设备与脉冲光源是同步的，从而在处理中可再现性地利用适宜的荧光成分，而舍弃不适宜的成分。优选将属于目标荧光 的光成分通过适宜的门控制用于成像，也就是说，如所实现的那样彼此相互独立。属于反射光或散射光的成分被舍弃。在某些情况下有意义的是，在照射后对可自由调节的时间范围内的荧光加以使用，而舍弃其它的光，或者将其归入或输入至少一个其它的探测通道。这对试样来说是至关重要的，对试样来说能够通过荧光寿命推测试样内部的局部情况。为应用本发明的设想，该成像探测器即“照相机”仅需将其门控制与光源有效地同步。这可如此实现，即提供显示为主机的中心触发设备，以该主机来触发光源和照相机。与之相反，所述光源例如在被动模式耦合激光器中也可形成主机触发信号，利用该主机触发信号触发照相机，或者照相机可由内置的或外设控制的时钟形成触发信号，然后以该触发信号同步所述光源。如果实现相应的配置，则在显微镜中易于实现反射光抑制/散射光抑制。在传统的显微镜中，仅这一点就已经有助于实现对复杂试样的成像。这个优点是可被利用的，只要弃用在显微镜中常规的荧光立方体并由此可达到比迄今为止明显更高的光谱自由度。当用中性分光片取代荧光立方体(例如50 50或80 20，即20%的反射的入射光，和80%的透射的荧光或其它分配比例)时，则还可将任意波长同时用于荧光激发，以及极端情况下甚至在相同波长下进行探测，且无反射光或散射光的问题。但为实现上述情况，特别有效的抑制是必需的，例如通过结合各类门控制方法来实现。此外还可考虑使用吸收滤光片、陷波滤光片、带宽滤光片、渐变滤光片或其它滤光片。在同时应用合适的偏振激发光时，使用偏振滤光片代替上述的中性滤光片还有助于进一步的反射光抑制/散射光抑制，虽然产生了探测灵敏度较低的后果。在此情况下要指出的是，“反射光抑制/散射光抑制”的概念不一定仅涉及试样的反射/散射，也可指在显微镜内部构件上的要加以抑制的反射/散射。特别有利的是，将中性滤光片即光谱较平坦的渐变滤光片或可调滤光片与可调谐光源或具有平坦光谱分布的光源(如白光源)相组合，照射光从所述光源的光谱中截取。通过这种组合可实现具有高灵敏度的全光谱可调谐的宽视野显微镜。由此可为所有试样找到其各自最佳的光谱照射设置，甚至可进行激发波长扫描。其也可与显微镜中的光谱探测相组合。在极端情况下，甚至可采用相应的组合激发光谱/发射光谱。本发明的技术可应用于所有具有成像设备的荧光显微镜中。旋转盘显微镜(spinning disc microscopy)、定位显微镜、TIRP显微镜、具有结构化照射的显微镜、SPIM显微镜等也属此列。本发明的技术可应用于反射光照射及透射光照射的荧光显微术。此时存在多种以有利的方式将发明技术方案进行设置和扩展的各种可能方法。为此，一方面可参阅权利要求I的从属权利要求，另一方面参阅以下根据附图对本发明的优选实施例的说明。结合根据附图对本发明的优选实施例的说明，还概述了该技术方案的有利设置和扩展。
图I以示意图示出了常规的、在实践中被熟知的具有滤光立方体的荧光显微镜的基本结构，
图2示出了本发明的显微镜的第一种实施例，其中所述照射设备包括可触发的LED,图3示出了本发明的显微镜的另一种实施例，其中应用了中性分光片或极性分光片，以及图4示出了本发明的显微镜的另一种实施例，其中应用了光学快速快门。
具体实施例方式图I以示意图示出了常规荧光显微镜的基本结构，其中借助于滤光立方体对激发光进行调谐。具体来说，在图I所示出的装置包括被作为光源的的照射设备I、位于照射设备I光路下游的聚光镜2和具有激发滤光片4和二向色分光片5的滤光立方体3。激发光6a经所述激发滤光片4通过物镜7到达试样8。来自试样8的突光/反射光6b通过物镜7经滤光立方体3、集成发射滤光片9被镜筒透镜10聚焦到探测器11，该探测器可设计成具有集成照相机芯片12的照相机。将如此得到的信号输入电子计算机13中，该电子计算机既包括图像处理设备还包括控制设备，特别是用于控制照射设备I。图2示出了本发明装置的第一种实施例，据此还应用了现有技术已知的滤光立方体3。使用可触发的LED作为脉冲式照射设备I。主机，具体来说是由电子计算机13控制或可经电子计算机13编程的触发设备/同步设备14被设计用于本发明的门控制。关于其它的如相应于图I的现有技术的结构特征，为避免重复可参阅对图I的描述。图3示出了在本发明装置的另一种实施例框架中使用中性分光片或偏振分光片15作为滤光立方体3的组件或其替代品。照射设备I设计成由用于本发明门控制的主机所指示的激光器。其触发信号被光基准传感器16截取。将该触发直接输入可门控制的照相机11，该照相机可包括集成分析装置。此处必要时可去掉外部触发设备。在图3的实施例中仅示例性地设计了两种呈照相机11形式的光谱探测设备。分度滤光片17用于对来自照射设备I的光线进行的特定光谱成分的提取。就此要指明的是，也可使用具有类似功能的其它元件如AOTF代替分度滤光片17。
图4示出了本发明装置的另一种实施例，其中借助光学快速快门18实现这样的装置。此外，在图4中还规定了，在本发明构想的一种特别有利的实施中，将中性分光片15固定组装在显微镜中，从而不需要或者说不再需要更换滤光立方体。关于本发明的显微镜的其它有利方案，为避免重复可参阅本对说明书的概述部分以及所附权利要求。最后要特别指出，以上所述本发明装置的实施例仅用于阐述所要求保护的技术方案，然而该技术方案不限于这些实施例。附图标记列表I 照射设备，光源2 聚光镜 3 滤光立方体4 激发滤光片5 二向色分光片，二向色镜6a 激发光6b 突光/反射光7 物镜8 试样9 发射滤光片10 镜筒透镜11 探测器，照相机12 照相机芯片13 电子计算机，数据处理设备14 触发/同步设备15 中性分光片，偏振分光片16 光基准传感器17 渐变滤光片18 光学快门
权利要求
1.一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲式光源⑴和成像探测器(11)，其特征在于，设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源(I)和探测器(11)的同步来达到反射光抑制/散射光抑制的目的，从而对适宜于处理的荧光成分加以利用，而对不适宜的成分进行舍弃。
2.根据权利要求I所述的显微镜，其特征在于，属于目标荧光的光成分能够通过门控制输入探测器(11)，并且属于反射光/散射光的那些光成分不用于成像。
3.根据权利要求I或2所述的显微镜，其特征在于，经照射后一定时间段的荧光是可用的，而在该时间段外的荧光不用于成像和/或能够被输入另一探测通道。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的显微镜，其特征在于，为所有像素提供一致的和/或同步的门控制。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的显微镜，其特征在于，对不同像素，能够实现不同的时间门控制或位置门控制。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的显微镜，其特征在于，用于所述门控制的装置包括限定主机的优选的中心触发设备(14)，通过该触发设备可触发光源和探测器。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其特征在于，所述光源(I)，尤其在模式耦合的激光器中，形成可触发探测器(11)的主机触发信号。
8.根据权利要求6所述的显微镜，其特征在于，所述探测器(11)，尤其是通过内置的或外设控制的时钟形成触发信号，所述光源(I)能够基于该触发信号同步。
9.根据权利要求I至8中任一项所述的显微镜，其特征在于，所述探测器(11)被设计成可门控制的照相机。
10.根据权利要求9所述的显微镜，其特征在于，所述照相机(11)包括可触发的/可门控制的快速光学快门(18)，或该快门在功能上配属于所述照相机(11)。
11.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述快门(18)设计成可快速控制的光学图像增强器，该增强器在接通状态下对光进行增强。
12.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，该快门(18)设计成光学吸收器，该吸收器通过短的光脉冲而饱和，并由此在施加门控制信号时变成透明的。
13.根据权利要求I至12中任一项所述的显微镜，其特征在于，所述探测器(11)能够如此进行门控制，即被相应地激活/去活。
14.根据权利要求I至13中任一项所述的显微镜，其特征在于，所述探测器(11)的输出在门控制的断开时间中短路和/或针对信号支路断开/中断。
15.根据权利要求I至14中任一项所述的显微镜，其特征在于，探测器(11)包括优选以盖革模式运行的雪崩光电二极管(APD)阵列，其中所述成像探测器(11)的每个单个像素均由单个APD组成，或由多个APD子阵组成。
16.根据权利要求I至14中任一项所述的显微镜，其特征在于，所述探测器(11)在产生探测信号后提供信息，所述信息将各信号成分鉴定为可用的或不可用的。
17.根据权利要求I至15中任一项所述的显微镜，其特征在于，将代表到达时间的时间标记或时间信号分布记录分配给每个光子或像素，用以在后置的数据处理设备(13)中决定该光子/像素是否可用于分析。
18.一种利用包括脉冲式光源和成像探测器的显微镜，特别是利用权利要求I至17中任一项所述的显微镜，进行成像荧光显微术，特别是进行宽视野荧光显微术的方法，其特征在于， 采用门控制用以生成成像可用信号，即通过门控制光源和探测器的同步，以达到反射光/散射光抑制的目的，从而将适宜于分析的荧光成分加以利用，而将不适宜的成分进行去除。
全文摘要
本发明涉及一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲光源(1)和成像探测器(11)，其特征在于，设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源(1)和探测器(11)的同步，以达到反射光/散射光抑制的目的，从而将适宜于分析的荧光成分加以应用，而将不适宜的成分进行去除。此外本发明还涉及一种利用本发明的显微镜实施成像式荧光显微术的方法。
文档编号G01N21/64GK102830097SQ201210206620
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月18日 优先权日2011年6月17日
发明者V·塞弗里德 申请人:徕卡显微系统复合显微镜有限公司
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