专利名称：胱抑素c胶体金免疫层析检测试纸条的制作方法
技术领域：
胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条技术领域[0001]本实用新型属于临床医学检验领域，具体涉及一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条。
背景技术：
[0002]胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员，是一种非糖基化的碱性蛋白，相对分子质量为13. 3%Da，等电点为8. 0-9. 5，由122个氨基酸组成。胱抑素 C基因无组织学特异性，广泛地存在各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精液等，机体胱抑素 C产生率相当恒定。而胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由过滤，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由肾小球过滤率(glomerular filtration rate, GFR)决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。[0003]胱抑素C在临床上被视为监测肾功能的一项高灵敏度、高特异性的指标。血清胱抑素C被认为是比肌酐、尿素氮等更理想、更灵敏的测定肾小球过滤率内源性指标；尿胱抑素C水平可以反映肾小球功能；另外胱抑素C在肾衰竭、肾移植、糖尿病肾病、高血压肾病等继发性肾病的早期检测机预后监测也有应用。[0004]胱抑素C最早采用单向免疫扩散法(RID)及酶免疫测定法(EIA)对胱抑素C含量进行测定，但这两种方法不仅费时，而且灵敏度也较差。较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定(RIA、FIA及EIA)的方法能改善胱抑素C的可靠性，但测定时间较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。均相溶胶颗粒型免疫测定方法虽然有利于生化仪清洗，但是操作繁琐如需要两种试剂反应，测定时间较长，灵敏度不高。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种操作简便、灵敏度高、能够快速检测的胱抑素C胶体金检测试纸条。[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案[0007]一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，包括样品垫、与所述样品垫一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的结合垫、与所述结合垫另一端紧密相连的硝酸纤维素膜、 以及与所述硝酸纤维素膜的另一端紧密相连的吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸均设置于底衬上，所述胶体金颗粒标记物为微信号放大系统，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素抗人胱抑素C抗体复合物，所述硝酸纤维素膜上包被有另一抗人胱抑素C抗体的检测线和包被有羊抗兔IgG的控制线。[0008]所述胶体金颗粒粒径大小为35_60nm。[0009]所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人胱抑素C抗体复合物用量为6-10 μ g/2cm ο[0010]所述胶体金颗粒标记抗人胱抑素C抗体与硝酸纤维素膜上包被的另一抗人胱抑素C抗体为配对的单抗或配对单抗-多抗。[0011]所述结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。[0012]一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法包括如下步骤[0013](I)制备微信号放大系统[0014]a.将待标记亲和素预先在O. 01mol/L pH7. O的NaCl溶液中4°C透析过夜，然后 4°C高速离心30min，以O. lmol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH至7. 5-8. 5，标记亲和素，形成胶体金标记亲和素；[0015]b.按常规方法制备生物素化抗人胱抑素C抗体；[0016]c.将步骤a得到的胶体金标记亲和素与步骤b得到生物素化抗人胱抑素C抗体连接，得到胶体金-亲和素-生物素-抗人胱抑素C抗体复合物，经过洗涤处理后，即得微信号放大系统；[0017](2)将步骤⑴的胶体金-亲和素-生物素-抗人胱抑素C抗体复合物按用量为 6-10 μ g/cm2喷涂在结合垫上,干燥12小时以上,备用；[0018](3)用包被缓冲液稀释另一种抗人胱抑素C抗体和羊抗兔IgG，将稀释后的两种抗体细致均匀地喷于硝酸纤维素膜上，两种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成检测线和控制线.[0019](4)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。[0020]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果[0021](I)本发明在现有检测试纸条的基础上，采用了生物素-亲和素微信号放大系统， 在检测样品中胱抑素C过程中，扩大了胱抑素C的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或漏检；[0022](2)本发明的试纸条具有操作简便(一步操作即可完成)和快速(检测时间5-8min) 等优点；[0023](3)本发明的试纸条还可以与配套仪器结合实现定量检测。
[0024]图I为本实用新型胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条结构示意图；[0025]其中，图I :1、底衬；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、检测线； 7、控制线。
具体实施方式
[0026]
以下结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。[0027]实施例I本发明胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条[0028]如图I所示，一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，包括样品垫2、与所述样品垫2 —端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的结合垫3、与所述结合垫3另一端紧密相连的硝酸纤维素膜4、以及与所述硝酸纤维素膜4的另一端紧密相连的吸水纸5，所述样品垫2、 结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5均设置于底衬I上，所述胶体金颗粒标记物为微信号放大系统，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素抗人胱抑素C抗体复合物，所述硝酸纤维素膜4上包被有另一抗人胱抑素C抗体的检测线6和包被有羊抗兔IgG控制线7。[0029]本发明的试纸条，所述胶体金颗粒粒径大小为35-60nm ;胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人胱抑素C抗体复合物用量为6-10 μ g/cm2 ;胶体金颗粒标记抗人胱抑素C抗体与硝酸纤维素膜4上包被的另一抗人胱抑素C抗体为配对的单抗或配对单抗-多抗；结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。[0030]实施例2本发明试纸制备方法[0031]I.胶体金溶液制备[0032]a.配制O. 01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，将IL该溶液加热至沸。[0033]b.搅动下准确加入Iml lmol/L K2CO3溶液，I分钟后准确加入1%柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7^H2O)水溶液 10ml。[0034]c.继续加热煮沸16分钟，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变成灰色，继而变成黑色，随后逐渐变成深红色并稳定。[0035]d.冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积即1L;制成胶体金溶液，其中胶体金颗粒的粒径约为60nm。[0036]2.制备微信号放大系统[0037]a.制备胶体金标记亲和素将待标记亲和素预先在0.01 mol/L pH7. O的NaCl 溶液中4°C透析过夜，以除去多余的盐离子，然后4°C 10 000离心30min，除去聚合物；以O.lmol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH至7. 5-8. 5，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；[0038]b.制备生物素化抗人IgG抗体先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素， 再使其与抗人胱抑素C单克隆抗体——Cys Cl (购自上海叶民生物技术有限公司)结合，然后在碳二亚胺作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩合，生成长臂生物素N-羟基丁二酰胺酯，即为生物素化Cys Cl，通过透析出去游离生物素；[0039]c.完成微信号放大系统将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到生物素化Cys Cl直接混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-Cys Cl复合物，经洗涤、离心处理后，即得微信号放大系统。[0040]3.将步骤2的胶体金-亲和素-生物素-Cys Cl复合物按用量为6-10 μ g/cm2 喷涂在玻璃纤维素膜3上，并在温度20-40°C，湿度10%-30%条件下烘干处理12小时以上， 备用;[0041]4.用包被缓冲液(主要成分是磷酸缓冲液、蔗糖)稀释抗人胱抑素C单克隆抗体——Cys C2 (购自上海叶民生物技术有限公司)至I. 5mg/ml，按膜液量O. 15μ 1/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜4上，形成检测线6 ;用包被液稀释羊抗兔IgG至2mg/ml，按膜液量O. 2 μ 1/mm,将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜4上，形成控制线7，置于20-40°C，湿度10%-30%条件下烘干处理12小时以上，备用；[0042]5.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、玻璃纤维素膜3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。[0043]实施例3本发明试纸另一种制备方法[0044]本实施例制备胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法与实施例2制备方法基本相同，区别仅在于所采用胶体金粒径大小的不同。本实施例所采用胶体金粒径大小为40nm,具体制备方法包括如下步骤[0045]a.配制O. 01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，将IL该溶液加热至沸。[0046]b.搅动下准确加入Iml lmol/L K2CO3溶液，I分钟后准确加入1%柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7^H2O)水溶液 14ml。[0047]c.继续加热煮沸16分钟，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变成灰色，继而变成黑色，随后逐渐变成深红色并稳定。[0048]d.冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积即1L;制成胶体金溶液，其中胶体金颗粒的粒径约为40nm。[0049]实施例4待测抗原检测[0050]将被检测血清、全血或尿液滴加100-120 μ I于样品垫2上,进行免疫反应，时间 5-8min,当检测线6和控制线7均显紫红色时，结果为阳性；当检测线6不显色，控制线7显紫红色，结果为阴性；当检测线6和控制线7均不显色时，表示试纸条失效。此外，还可以将试纸条放入南京基蛋生物科技有限公司的FIA8000免疫定量分析仪中读取信号，根据信号读数计算浓度，进行定量检测。
权利要求1.一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于包括样品垫(2)、与所述样品垫(2)—端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的结合垫(3)、与所述结合垫(3)另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(4)、以及与所述硝酸纤维素膜(4)的另一端紧密相连的吸水纸(5)，所述样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)均设置于底衬(I)上，所述胶体金颗粒标记物的结合垫(3)是胶体金颗粒标记胱抑素C抗体的结合垫(3)，所述硝酸纤维素膜(4)上包被有另一抗人胱抑素C抗体的检测线(6)和包被有羊抗兔IgG控制线(7)。
2.根据权利要求I所述胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于所述胶体金颗粒标记物的结合垫(3)的胶体金颗粒粒径大小为35-60nm。
3.根据权利要求I所述胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于所述结合垫(3)材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
专利摘要本实用新型公开了一种胱抑素C胶体金免疫层析检测试纸条，属于临床医学检验领域。该试纸条包括样品垫(2)、与所述样品垫(2)一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的结合垫(3)、与所述结合垫(3)另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(4)、以及与所述硝酸纤维素膜(4)的另一端紧密相连的吸水纸(5)，所述样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)均设置于底衬(1)上，所述胶体金颗粒标记物的结合垫(3)是胶体金颗粒标记胱抑素C抗体的结合垫(3)，所述硝酸纤维素膜(4)上包被有另一抗人胱抑素C抗体的检测线(6)和包被有羊抗兔IgG控制线(7)。本实用新型试纸条具有操作简便、检测快速、灵敏度高等优点。
文档编号G01N33/558GK202814977SQ20122042042
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者苏恩本, 王勇, 黄力, 陈伟, 周超 申请人:南京基蛋生物科技有限公司
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