专利名称：一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，尤其是一种用于土壤污染生物标记物筛选的动物蛋白质样品的制备方法。
背景技术：
蛋白质组学是近年来兴起的一门新兴学科，其主要的技术为双向凝胶电泳Q-DE) 和质谱分析技术，可从总体水平上揭示细胞内蛋白的差异表达情况。目前双向电泳一般只能分辨到1000 3000个蛋白质(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此在做双向电泳之前对样品的处理非常重要。样品制备是双向电泳中最关键的步骤，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。但就目前来说，并没有一个比较标准或者通用的样品制备方法。现在常用的样品制备方法都采用三步法样品破碎、沉淀蛋白和去除杂质。现有采用的样品破碎手段极易造成样品中蛋白的丢失或导致蛋白被修饰。此外，在蛋白沉淀的步骤也极易引起蛋白的降解和被修饰。去除杂质的技术关键也是尽量减少蛋白丢失和蛋白修饰。由此可见，迄今，蛋白质组学分析中蛋白质样品的制备方法尚没有一个通用的技术，需要经过大量的实验摸索和经验积累才能确保实验结果的可信准确。在研究蛋白的过程中， 既需要严谨的技术流程但又不能拘泥于经验。因此，改进实验流程和样品制备技术，减少蛋白丢失、降解(或破坏)和减少对蛋白质的人为修饰或被修饰，减少蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。实现低丰度目标蛋白点的高效分离具有重要的意义。
发明内容
本发明提出一种通过组织原位采集和显微放大捕获切割的方法，可以大大减少杂蛋白含量和降解丢失，减少蛋白的人为修饰，在双向凝胶电泳0-DE)实现动物组织低丰度目标蛋白点的高效分离上效果非�：�。本发明采用的技术方案是一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，所述方法包括(1)组织标本获取剥离蚯蚓的表皮组织，清洗、用滤纸吸去多余液体，所得组织标本于液氮中速冻后移至-80°C冰箱保存；生物的选择和组织确定土壤无脊椎动物—— 蚯蚓，确定组织为表皮组织。(2)冰冻切片组织标本从-80°C冰箱取出后，用-30°C的冰冻切片机切片，切片厚度10 μ m，每例标本第1张切片用HE染色，以后每张切片只做苏木精染色。第1张切片HE 染色主要用于组织的识别定位，以后每张切片的苏木精染色是为了确保目标蛋白质在染色的同时还处于完全变性状态；(3)显微捕获切割将制备好的切片放在显微镜的载物台上，直视下比较观察选定要切割的区域，按最大捕获效率设定参数，具体为光束直径(beam diameter)60 μ m, 光束能量(beam power) 80mV，激光传递脉冲(transfer pulses)为1.6ms，捕获切割取得40000 50000个细胞，通过软件对所获取的细胞计数；(4)样本制备切割下来的细胞加入组织裂解缓冲液中，冰浴振荡30 40min， 再1 5°C下超声处理2 5次后，离心O0000 X g，lh)，取上清，即得蚯蚓蛋白质样品， 贮存于-80°C冰箱备用，同时用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质浓度；所述组织裂解缓冲液组成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/L DTT，0. 2 %两性电解质 (Ampholyte 电泳级，pH3. 0 9· 5, Amresco 公司),10ml/L cocktail。优选的，步骤(4)组织裂解缓冲液组成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS,65mmol/L DTT，0· 2%两性电解质，10ml/L cocktail。在土壤动物生物标记物筛选过程中，可采用上述方法获得蛋白质样品，再按照下述方法进行进一步分析(A)双向凝胶电泳取上述蛋白质样品100 μ g加入重泡胀液至终体积350 μ 1混勻。将样本均勻加入持胶槽中，胶面向下放入17cm IPG干胶条，滴加矿物油，置于等电聚焦仪上，重泡胀过夜，等电聚焦在19 °C下自动进行。等电聚焦后，IPG胶条分别在平衡液A (含 20g/L DTT)和平衡液B (含25g/L碘乙酰胺)中各平衡15min，将平衡后的IPG胶条置于 12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝胶上方，胶条端滴加宽范围的蛋白标记物，低溶点琼脂糖封闭，电泳参数5mA/胶lh，待溴酚蓝前沿移入SDS胶时，以30mA/胶他直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约0. 5cm时为止。(B)硝酸银染色40%乙醇+10%冰乙酸固定60min — 6. 8%乙酸钠+30%乙醇 +0. 2% Na2S2O3敏化30min —去离子水漂洗5minX3次一0. 2%硝酸银染色20min —去离子水漂洗IminX 2次一2. 5%无水碳酸钠+0. 04%甲醛显色5%冰乙酸终止IOmin — 10%甘
油保存。(C)凝胶图像采集与分析应用扫描仪MICROTEK 4850II采集凝胶图像，在相同条件下，对两种细胞的总蛋白样品分别进行3次双向电泳及图像分析，在同种细胞的蛋白质电泳图谱中选择蛋白质点清晰的图像作为参照，与其他2次电泳的图像进行匹配，然后将3 次电泳所得的蛋白质点图谱在PDQuest2Dversi0n 7. 4软件中创建平均胶，对2种细胞的平均胶进行匹配，选取表达水平(相对体积)增加2倍及2倍以上的点，得出差异表达点。(D)质谱鉴定选取胶上差异蛋白质点，用刀片沿斑点染色边缘切下，置于 Eppendof管中，进行蛋白质胶内消化，然后进行MALDI-T0F质谱鉴定。借助互联网上的蛋白质数据库检索程序 NCBInr (http //prospector, ucs. f edu)。(E)生物标志物的筛选与确定分析表皮组织细胞的蛋白质图谱，研究蛋白质图谱的特征及其与土壤中污染物的种类与含量的关系，确定表征污染物的差异表达点，找出对应的质谱数据，筛选确定生物标记物。上述土壤生物标记物的筛�。梢允视迷赑Cffs单一和复合污染土壤生态毒性的早期诊断和生态风险评估中本发明的有益效果主要体现在通过组织冰冻实现蛋白原位固定，对目标区域进行显微捕获切割，将切割下来的细胞通过组织裂提取总蛋白，改进了实验流程和样品制备技术，大大地减少了蛋白丢失、降解(或破坏)以及对蛋白质的人为修饰，减少了蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并可使蛋白质处于完全变性状态，为实现低丰度目标蛋白点的高效识别分离效果很好，适用于蛋白质生物标志物的筛选与确定。
图1为蚯蚓菲污染暴露7天和14天表皮组织蛋白双向凝胶电泳图，Control为空白对照；treatment为污染暴露组(Phe 12. 5mg · kg-1 ；箭头指示可能的差异蛋白点)；图2差异蛋白点971的肽质量指纹图谱，对差异蛋白点971切胶，trypsin消化， MALDI-T0F/T0F分析；A，MS分析图，1222. 608离子星号标记；B，1222. 608离子MS/MS分析图。图3为蚯蚓菲、芘复合污染暴露14天表皮组织蛋白双向凝胶电泳图， (Phe20. Omg · kg^+Pyr 300. Omg · kg-1 ；箭头指示可能的差异蛋白点)；图4为差异蛋白点四的肽质量指纹图谱，对差异蛋白点四切胶，trypsin消化， MALDI-T0F/T0F 分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 菲污染土壤生物标志物的筛选(1)蚯蚓的慢性毒性试验采用人工配制的菲单一污染的土壤，设置对照组和实验组，实验组菲的浓度为 12. 5mg -kg^Phe,设3个平行组。分别于培养开始后7d和14d从每个实验组和对照组中随机取各种试验动物的3个个体。(2)生物标志物的筛选与确定1)蛋白样品的准备剥离被抽取的动物表皮组织，于冰盐水(含0. lmmol/L PMSF) 中清洗干净，滤纸吸去多于液体，立即置于液氮中速冻，然后移至-80°C冰箱保存。组织标本从_80°C冰箱取出后，立即移入温度设置为-30°C的冰冻切片机中，切片厚度10 μ m,每例标本第1张切片用HE染色，以后每张切片只做苏木精染色。将制备好的切片放在显微镜的载物台上，直视下观察选定要切割的区域，按最大捕获效率设定参数。具体为光束直径 (beam diameter) 60 μ m,光束能量(beam power) 80mV,激光传递脉冲(transfer pulses)为 1. 6ms,按此法取得40000 50000个细胞，并通过软件对所获取的细胞计数。切割下来的细胞通过组织裂解缓冲液(8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/LDTT, 0. 2%两性电解质(Ampholyte 电泳级，ρΗ3· 0 9. 5，Amresco 公司)，10ml/Lcocktail)提取总蛋白， 加入裂解液后，冰浴振荡30min，再低温超声数次后，给予4°C，20 OOOXg离心lh，取上清， 分装，贮存于-80°C冰箱，同时用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质浓度。2)双向凝胶电泳取上述蛋白质样品100 μ g加入重泡胀液至终体积350 μ 1混勻。将样本均勻加入持胶槽中，胶面向下放入17cm IPG干胶条，滴加矿物油，置于等电聚焦仪上，重泡胀过夜，等电聚焦在19°C下自动进行。等电聚焦后，IPG胶条分别在平衡液A(含 20g/L DTT)和平衡液B (含25g/L碘乙酰胺)中各平衡15min，将平衡后的IPG胶条置于 12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝胶上方，胶条端滴加宽范围的蛋白标记物，低溶点琼脂糖封闭，电泳参数5mA/胶lh，待溴酚蓝前沿移入SDS胶时，以30mA/胶他直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约0. 5cm时为止。
3)硝酸银染色40%乙醇+10%冰乙酸固定60min — 6. 8%乙酸钠+30%乙醇 +0. 2% Na2S2O3敏化30min —去离子水漂洗5minX3次一0. 2%硝酸银染色20min —去离子水漂洗IminX2次一2. 5%无水碳酸钠+0. 04%甲醛显色5%冰乙酸终止IOmin — 10%甘
油保存。4)凝胶图像采集与分析应用扫描仪MICROTEK 4850II采集凝胶图像，在相同条件下，对两种细胞的总蛋白样品分别进行3次双向电泳及图像分析，在同种细胞的蛋白质电泳图谱中选择蛋白质点清晰的图像作为参照，与其他2次电泳的图像进行匹配，然后将3 次电泳所得的蛋白质点图谱在PDQuest2Dversi0n 7. 4软件中创建平均胶，对2种细胞的平均胶进行匹配，选取表达水平(相对体积)增加2倍及2倍以上的点，得出差异表达点。5)质谱鉴定选取胶上差异蛋白质点，用刀片沿斑点染色边缘切下，置于 Eppendof管中，进行蛋白质胶内消化，然后进行MALDI-T0F质谱鉴定。借助互联网上的蛋白质数据库检索程序 NCBInr (http //prospector, ucs. f edu)。6)生物标志物的筛选与确定分析表皮组织细胞的蛋白质图谱，研究蛋白质图谱的特征及其与土壤中污染物的种类与含量的关系，确定表征污染物的差异表达点，找出对应的质谱数据，筛选确定生物标记物。通过比较分析蛋白质图谱，结果第7天暴露找到48个差异蛋白点，第14天暴露找到73个差异蛋白点，通过表达丰度分析和质谱鉴定，筛选出31种有意义的蛋白，其中17种蛋白在蚯蚓表皮细胞表达明显增高，14种蛋白表达下调，结果详见图1、图2 ；表1、表2。筛选出的31种有意义的蛋白即可确定为低浓度菲污染的土壤生物标志物，可用于生态毒性的早期诊断和生态风险评估。实施例2 菲、芘复合污染土壤生物标志物的筛选(1)蚯蚓的慢性毒性试验采用人工配制的菲、芘单一污染以及复合污染的土壤，按下表进行污染物的浓度梯度设置，设3个平行组。分别于培养开始后7d和14d从每个实验组和对照组中随机取各种试验动物的3个个体。表3 污染物的浓度梯度设置
权利要求
1.一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，所述方法包括(1)组织标本获取剥离蚯蚓的表皮组织，清洗、用滤纸吸去多余液体，所得组织标本于液氮中速冻后移至-80°C冰箱保存；(2)冰冻切片组织标本从-80°C冰箱取出后，用-30°C的冰冻切片机切片，切片厚度 10 μ m,每例标本第1张切片用HE染色，以后每张切片只做苏木精染色；(3)显微捕获切割将制备好的染色切片放在显微镜的载物台上，直视下比较观察选定要切割的区域，按最大捕获效率设定参数，具体为光束直径60 μ m，光束能量80mV，激光传递脉冲为1.6ms，捕获切割取得40 000 50 000个细胞，通过软件对所获取的细胞计数；(4)样本制备切割下来的细胞加入组织裂解缓冲液中，冰浴振荡30 40min，再1 5°C下超声处理2 5次后，离心，取上清，即得蚯蚓蛋白质样品，贮存于-80°C冰箱备用；所述组织裂解缓冲液组成如下8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4% CHAPS, 65mmol/LDTT, 0. 2%两性电解质，10ml/L cocktail。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑷组织裂解缓冲液组成如下8mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4% CHAPS，65mmol/L DTT，0. 2%两性电解质，10ml/L cocktail。
全文摘要
本发明提供了一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，通过组织冰冻实现蛋白原位固定，对目标区域进行显微捕获切割，将切割下来的细胞通过组织裂提取总蛋白，改进了实验流程和样品制备技术，大大地减少了蛋白丢失、降解(或破坏)以及对蛋白质的人为修饰，减少了蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并可使蛋白质处于完全变性状态，为实现低丰度目标蛋白点的高效识别分离效果很好，适用于蛋白质生物标志物的筛选与确定。
文档编号G01N1/30GK102288467SQ20111020484
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者吴石金, 沈飞超, 赵士良, 邱乐泉, 钟卫鸿 申请人:浙江工业大学
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