专利名称：一种过氧化氢生物传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种过氧化氢生物传感器及其制备方法。
背景技术：
H2O2作为一种重要的化工产品，兼具杀菌、漂白、氧化和消毒等多种功效。它的应用十分广泛，所以对H2O2含量的测定在生物制药、食品科学、工业分析、环境监测和临床化学等领域具有非常重要的意义。现在检测H2O2时采用的主要手段有荧光法、化学发光法、 电化学法、光谱法和滴定法等。近年来，电化学方法，尤其是基于酶的直接电化学的无媒介体生物传感器得到了迅速的发展，这是因为用电化学方法研制的H2A生物传感器其制备简单，成本低，并且具有很高的选择性和灵敏度。另外，酶在生物体内以及药物和食物中有极为重要的作用，而H2O2作为生物体内许多过氧化酶参与酶促反应的副产物，对其浓度进行准确测定则具有十分重要的研究意义。生物传感器具有对酶的分子识别和催化选择功能，使用它来检测H2A浓度不但能体现出操作便捷，响应迅速快的特点，而且只需少量的试样就可以检测出H2A的浓度。因此，如何在对H2A进行精确检测时充分发挥生物传感器的信号检测高灵敏性和反应高度专一性等优势，将会是研究者们为之不断奋斗的目标。生物纳米材料具有生物兼容性好、比表面积大和稳定性高等特点，并且其表面所带有的功能基团能对酶的电化学行为产生特有的催化效应。环境友好型试剂肌醇六磷酸钙 (Ca-IP6)，其分子的结构上含有6个非共平面的磷酸酯键，使其具有很强的螯合多价金属离子的能力，Ca2+也具有很强的螯合能力，因此肌醇六磷酸钙比其他肌醇六磷酸盐都易与带正电的蛋白质或金属和金属氧化物纳米粒子通过螯合和静电作用结合。这些独特的性质类似于生物磷酸酯膜，与蛋白质或酶结合，为酶在生物传感器的固定上提供良好的微环境，实现酶与电极之间的直接电子转移，用于高灵敏度检测H2A。迄今为止，国内外尚未有利用“绿色经济”肌醇六磷酸钙膜制备的检测过氧化氢的生物传感器。所以发明一种检测限低，响应时间短，米氏常数较�。槊舳雀撸榷ㄐ院玫募觳釮2A的生物传感器是一个迫切需要解决的重要技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测限低，响应时间短，米氏常数较�。槊舳雀撸榷ㄐ院玫募觳釮2A生物传感器及其制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种过氧化氢生物传感器的制备方法，包括如下步骤(1)将肌醇六磷酸钙溶液在90°C下加热回流30分钟；(2)将步骤(1)所得肌醇六磷酸钙溶液滴在经预处理的玻碳电极(GCE)表面并于 4 8°C冰箱内晾干，得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极；(3)将辣根过氧化物酶(HRP)溶液滴涂固定到步骤( 所得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极上，置4 8°C冰箱内晾干，得辣根过氧化物酶-肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极；(4)将全氟磺酸(Nafion)溶液滴加到步骤( 所得的辣根过氧化物酶-肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极上，于4 8°C冰箱内晾干；步骤(1)中所述肌醇六磷酸钙溶液的浓度为0. 001 0. 002mol/L。步骤( 所述预处理的过程如下用氧化铝粉抛光处理玻碳电极，再依次用去离子水，无水乙醇，去离子水清洗，最后超声清洗3 5分钟，使得玻碳电极表面无划痕。步骤(3)中HRP溶液为HRP的PBS溶液，浓度为3 8mg/mL，溶液pH为7. 4 7. 5。步骤⑷中溶液全氟磺酸溶液浓度为Iwt% 1. 5wt%。根据以上技术方案制得的过氧化氢生物传感器，其特征在于，包括玻碳电极，玻碳电极表面修饰有肌醇六磷酸钙膜，肌醇六磷酸钙膜上修饰辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶膜表面再修饰一层全氟磺酸膜。本发明采用自组装方法，利用肌醇六磷酸钙作为连接剂，通过磷酸酯键及Ca2+的静电和螯合作用将HRP吸附到电极表面，获得了 Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE传感器，所采用的肌醇六磷酸钙是一种用途广泛的药物原料，其具有生物相容性好、易降解、无毒副作用等优良的生物性能。由于上述技术方案的采用，本发明制备的电极中的辣根过氧化物酶保持了很好的生物活性，实现了与电极表面的直接电子转移，对过氧化氢有很好的响应，并具有检测限低、响应时间短、电催化活性高和稳定性良好等优点，是一种优良的检测过氧化氢的新型生物传感器。同时，本发明的制备方法还具有操作简单、绿色环保、成本较低的优点。
图1为本发明中不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图。图2为本发明中Ca_IP6、HRP这两种溶液及混合溶液的紫外-可见吸收光谱图。图3为不同修饰电极的循环伏安图。图4为本发明传感器对不同浓度H2A的循环伏安图。图5为本发明传感器在PBS中连续加入H2A的计时电流响应曲线。图6为本发明响应电流与H2A浓度的校正曲线的计时电流图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。实施例本实施例电化学实验在CHI 660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上进行；紫外-可见(UV-vis)光谱实验采用UV-8500型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；其他仪器为FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)； SK2200H超声仪(上�？频汲瞧饔邢薰�)。本发明过氧化氢生物传感器的制备方法如下(1)将0. 001mol/L的肌醇六磷酸钙溶液在90°C下加热回流30分钟；
(2)移取4 μ L上述肌醇六磷酸钙溶液滴加到预处理过的玻碳电极表面(7mm2)，于 4°C冰箱内晾干，得到修饰肌醇六磷酸钙(Ca-IP6)膜的玻碳电极(Ca-IP6/GCE)；( 取4 μ L 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液滴涂在上述玻碳电极上，置4°C冰箱内晾干，得辣根过氧化物酶-肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极(HRP/Ca-IP6/GCE)；(4)将质量分数为5%的全氟磺酸溶液用pH 7. 0磷酸缓冲液稀释至质量分数为 1%>ρΗ = 7. 0，滴加3μ L所得全氟磺酸溶液，置4°C冰箱内晾干，即得本发明的过氧化氢生物传感器(Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE)。电化学交流阻抗技术(EIQ可以根据电极在修饰过程中阻抗的变化表征电极组装的不同阶段，是一种研究表面修饰电极界面性质的有效手段。图1是不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图，利用电化学交流阻抗法(EIS) 表征了 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 制备过程曲线(a)是裸玻碳电极的交流阻抗曲线，近似为一条直线，表明裸玻碳电极表面的电子迁移几乎不受什么阻碍，其表面传递的电子受扩散控制；曲线(b)是在裸电极上修饰了 Ca-IP6后的交流阻抗谱，由图可观察到一个微小的半圆，表明Ca-IP6膜的形成使 [Fe(CN)6]4_Λ_在电极表面的电子转移阻力加大；曲线(c)是自组装HRP之后的交流阻抗谱， 由图看出HRP/Ca-IP6/GCE(c)半径明显增大，这说明HRP通过与Ca-IP6的磷酸酯键和Ca2+ 的螯合作用，吸附于电极表面，在电极表面形成了介电子层，阻碍了 Fe (CN)广/Fe (CN) 64-在电极表面的电子传递过程；由曲线(d)可以看出，Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE阻抗弧的半径表明电子在电极表面的迁移更加困难，因此证明HRP成功地固定到了玻碳电极上。紫外可见光谱能够有效的监测亚铁血红素基团吸收带的变化，以表征其结构的变化。图2是本发明中Ca_IP6、HRP这两种溶液及混合溶液的紫外-可见吸收光谱图在波长396nm处出现HRP (b)的吸收峰，而Ca-IP6 (a)在所给的波长范围内没有任何吸收峰；当HR和Ca-IP6混合后，混合溶液HRP-Ca-IP6 (c)中HRP的Soret吸收带位置与纯HRP溶液中的Soret吸收带位置基本一致，说明在Ca-IP6溶液中的HRP能够保持自身天然的生物活性和天然结构。图3为不同修饰电极的循环伏安图，显示(a)裸玻碳电极，(b)Nafi0n/Ca-IP6/ GCE, (c)Nafion/HRP/GCE 和(d) Naf ion/HRP/Ca_IP6/GCE 在 PBS 中的循环伏安(CV)响应信号。结果表明，在裸玻碳电极(a)和Nafi0n/Ca-IP6/GCE(b)中未观察到任何峰，在曲线(d)Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE上可以观察到一对明显的氧化还原峰，而在(c) Naf ion/HRP/ GCE上有一对小峰，这说明Ca-IP6的存在促进HRP在电极表面的直接电化学行为，为HRP提供一个具有生物相容性的界面，有效地加快HRP的直接电子转移速率。另外，Nafion膜起到了保护HRP生物活性，防止酶流失的作用。图4为本发明传感器对不同浓度H2A的循环伏安图，考察了 Nafion/HRP/Ca-IPy GCE对H2A的电催化性能。从图上可以观察到，在PBS (pH = 7.0)溶液中，当H2O2加入到PBS后，Naf ion/HRP/ Ca-IP6/GCE中HRP的!^3+的还原峰电流随着H2A浓度的增加而逐渐增大，对应的HRP的!^2+ 的氧化峰电流逐渐减小乃至消失，表明Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE对H2A具有良好的电催化还原性能，也进一步证明了 Ca-IP6保持了 HRP的电催化活性。图5是本发明传感器Naf ion/HRP/Ca_IP6/GCE在-0. 25V的工作电位下，向PBS (pH 7.0)中连续加入H2O2的计时电流响应曲线，随着H2O2浓度的不断增大，还原电流逐渐增大。图6为本发明响应电流与H2A浓度的校正曲线的计时电流图，反映了该传感器在不同H2O2浓度下对催化电流的线性校正关系，看出响应电流和过氧化氢的浓度成线性关系，在2. 67 ΧΙΟ—7 1.067 X 10_6mOl L—1浓度范围内，相关系数为0. 998 (n = 10)，最低检测限为 1. 3Xl(T7mol L-l(信噪比 S/N = 3)。表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant,^")是一种与酶的浓度无关的酶促反应特征常数，它可以表征酶与底物之间亲合力的大小。可以通过Lineweaver-Burk方程求得1/Iss =^f/ImaxC + 1/Imax式中，Iss是加入底物后测得的稳态电流，C是底物浓度，Imax是底物达饱和后测得的最大电流。米氏常数可根据稳态电流的倒数和H2A浓度的倒数作图后，所得到的斜率和截距求得。按此公式测得Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE的米氏常数为0. 259mmol L—1，此处表观米氏常数较低的米氏常数远远小于文献中所报道的值，表明用该方法制作的传感器对辣根过化物酶有较高的活性，且具有更大的亲和力。将本发明传感器Nafion/HRP/Ca_IP6/GCE 对同一浓度 H2R 溶液(0. Immol L—1)进行测定，重复5组数据的相对标准偏差(R.S.D.)为3.0%。用相同方法所制备的6支不同Naf i0n/HRP/Ca-IP6/GCE电极，对H2O2溶液(0. Immol L—1)的电流检测的相对标准偏差为 6. 8%，这表明Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE有较好的重现性。将修饰好的电极在pH为7. 0的PBS溶液中在扫速为lOOmV—1下进行循环扫描50 圈，峰电位不变，峰电流仅下降3. 6%。实验后将修饰电极于4°C下置于pH为7. 0的PBS溶液中放置一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的94%，一个月后， 其响应信号仍为初始信号的91%，这表明Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE具有较好的稳定性。上述实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
权利要求
1.一种过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将肌醇六磷酸钙溶液在90°c下加热回流30分钟；(2)将步骤(1)所得肌醇六磷酸钙溶液滴涂在经预处理的玻碳电极表面于4 8°C冰箱内晾干，得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极；(3)将辣根过氧化物酶溶液滴涂固定到步骤( 所得肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极上，置4 8°C冰箱内晾干，得辣根过氧化物酶-肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极；(4)将全氟磺酸溶液滴加到步骤( 所得的辣根过氧化物酶-肌醇六磷酸钙膜修饰的玻碳电极上，置4 8°C冰箱内晾干后，制备得辣根过氧化物酶-植酸钙膜修饰的玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述肌醇六磷酸钙溶液的浓度为0. 001 0. OOaiiol/L。
3.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤( 所述预处理的过程如下用氧化铝粉抛光处理玻碳电极，再依次用去离子水，无水乙醇，去离子水清洗，最后超声清洗3 5分钟。
4.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中 HRP溶液为HRP的PBS溶液，浓度为3 8mg/mL，溶液pH为7. 4 7. 5。
5.根据权利要求1所述的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中溶液全氟磺酸溶液的浓度为Iwt% 1. 5wt%。
6.根据权利要求1 5所述制备方法制得的过氧化氢生物传感器，其特征在于，包括玻碳电极，玻碳电极表面修饰有肌醇六磷酸钙膜，肌醇六磷酸钙膜上修饰辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶膜表面再修饰一层全氟磺酸膜。
全文摘要
本发明公开了一种过氧化氢生物传感器及其制备方法，采用自组装方法，利用肌醇六磷酸钙作为连接剂，通过磷酸酯键及Ca2+的静电和螯合作用将HRP吸附到电极表面，获得了Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE传感器，所制备的传感器与酶底物的亲和力高，能够实现辣根过氧化物酶的直接电子转移，对过氧化氢的响应时间短，检测限低，灵敏度高等性能，同时，本发明制备方法简单，环保经济。
文档编号G01N27/327GK102495116SQ20111038843
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者接德丽, 杨海峰 申请人:上海师范大学
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