专利名称：Tmb显色体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物体外诊断试剂，具体地说是TMB显色体系。
背景技术：
建立高效稳定的酶联免疫检测ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assays)技术平台，是许多实验室和临床检验工作者多年来的夙愿。近年来，由于ELISA方法在临床检测及生物药物检测的广泛应用，检测要求从之前的定性检测发展到今天定量分析。随着这种检测要求的转化，对于检测方法的精准性和稳定性提出了更高要求。检测的数据质量也由之前的“差不多”发展到今天的“不能差”。为了保证ELISA方法的稳定可靠，需要很多 环节的优化和密切配合，由于显色的质量直接影响到了 ELISA方法的成败和检测的数据质量，因此，TMB显色剂配制虽然是该方法的最后一步，却是最关键的一步。TMB即四甲基联苯胺(3，3’ , 5, 5’ -Tetramethylbenzidine)是一种脂溶性较强的物质，经与HRP作用后的产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。反应后用HCL或H2SOj*止后，TMB产物由蓝色呈黄色，使用酶标仪进行检测，最适吸收波长为450nm。目前TMB显色剂配制方法很多，市售的显色剂不仅价格昂贵，而且储存有效期短，在使用过程中对操作的准确性要求高；有很多实验室自行配制，但配制方法多种多样没有统一的标准和规范；在研究论文中使用的TMB显色剂也是五花八门，对于检测数据的对比及验证造成了困难。因此需要研制用于生物体外诊断的灵敏高效、稳定、易用及配置简单的TMB显色体系是当务之急。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种适宜在实验室使用的灵敏高效、稳定、易用、配置简单且成本低廉的酶联免疫TMB显色体系。本发明的目的是这样实现的
本TMB显色体系，包括TMB储存液和TMB底物缓冲液母液，其中，所述TMB储存液由以下原料按如下重量体积比配制
TMB4. 5 5. 2g
DMSO450mL
甘油50mL ；
所述TMB底物缓冲液母液由以下原料按如下重量体积比配制
醋酸钠· 3H20100 120g
柠檬酸· H2O90 IlOg
加入蒸馏水800mL
用浓盐酸调节PH至3. O 4. O加入蒸馏水定容至1000 HiL制得TMB底物缓冲液母液。本发明的TMB显色体系中，所述TMB储存液优选由以下原料按如下重量体积比配制
TMB5. Og
DMSO450mL 甘油50mL ；
所述TMB底物缓冲液母液优选由以下原料按如下重量体积比配制
醋酸钠· 3H20113. Og
柠檬酸· H2O105. Og
加入蒸馏水800mL
用浓盐酸调节PH至3. 6
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液。本发明的TMB显色体系，可按以下方法配成显色剂
①配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液IOmL
H2O2 (30%)0.30 0.40mL;
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液；
②所述TMB储存液和所述TMB底物缓冲液工作液按体积比为20 100 1000的比例混合制得TMB显色剂。本发明的TMB显色体系，配制所述的TMB底物缓冲液工作液时，H2O2 (30%)加入量优选为O. 33mL。TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液优选按体积比为I : 50的比例混合制得TMB显色剂。TMB显色剂的配制方法包括以下步骤
①由以下原料按如下重量体积比配制TMB储存液
TMB5. Og
DMSO450mL
甘油50mL ；
②由以下原料按如下重量体积比配制TMB底物缓冲液母液
醋酸钠· 3H20100 120g
柠檬酸· H2O90 IlOg
加入蒸馏水800mL
用浓盐酸调节PH至3. O 4. O
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液；
③配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液IOmL
H2O2 (30%)0.30 0.40mL;
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液；
④所述TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液按体积比为20 100 1000的比例混合制得TMB显色剂。
TMB显色剂的配制方法优选按以下步骤制备
①由以下原料按如下重量体积比配制TMB储存液
TMB5. Og
DMSO450mL
甘油50mL ；
②由以下原料按如下重量体积比配制TMB底物缓冲液母液
醋酸钠· 3H20113. Og
柠檬酸· H2O105. Og 加入蒸馏水800mL
用浓盐酸调节PH至3. 6
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液。③配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液 IOmL
H2O2 (30%)O. 33mL ；
加入蒸馏水定容至IOOOmL制得TMB底物缓冲液工作液；
④所述TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液按体积比为I : 50的比例混合制得TMB显色剂。本发明中，所述TMB储存液是由TMB、DMSO及甘油混匀溶解制得。首先将称取的TMB加入到DMSO中搅拌混匀，至TMB完全溶解，再加入量取的甘油搅拌混匀即可。本TMB储存液于4°C避光保存，可使用期限为3年
本发明中，所述TMB底物缓冲液母液的配制过程将称取的醋酸钠·3Η20、柠檬酸·Η20加以蒸馏水搅拌至盐分完全溶解，以浓盐酸调节PH至3. O 4. 0，优选PH为3. 6，再经定容制成。本TMB底物缓冲液母液于4°C避光保存，可使用期限为3年。本发明的TMB显色体系为双组份显色体系，其应在使用时随时配制，配制完成后应在30分钟内使用。本发明的显色体系在配制时，首先将TMB底物缓冲液母液配制成TMB底物缓冲液工作液，再按配制比例，制得TMB显色剂。
图I为实施例I所制TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液的配比与显色剂性能关系图。
具体实施例方式实施例I
(O按用量取下述原料配制TMB储存液
TMB5g
DMSO450mL
甘油50mL。所制TMB储存液于4°C避光保存，有效期三年，随用随取。(2)按用量取下述原料配制TMB底物缓冲液母液
醋酸钠· 3H20113. Og柠檬酸· H2O105. Og
加入蒸馏水800mL
用浓盐酸调节PH至3. 6
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液。所制TMB底物缓冲液母液于4°C避光保存，有效期三年，随用随取。(3)配制TMB显色剂
① 配制TMB底物缓冲液工作液
TMB底物缓冲液母液IOmL H2O2 (30%)O. 33mL ；
加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液。② 取IOmL TMB底物缓冲液工作液中加入O. 2mL TMB储存液制得TMB显色剂。所配制的TMB显色剂应在30分钟内使用。实施例2-10的配制方法同实施例1，各实施例的原料配比依照表I进行.
表I实施例2-10中TMB显色体系中各种相关组分含量表
权利要求
1.ー种TMB显色体系，包括TMB储存液和TMB底物缓冲液母液，其特征在干， 所述TMB储存液由以下原料按如下重量体积比配制 TMB4. 5 5. 2g DMSO450mL 甘油50mL ； 所述TMB底物缓冲液母液由以下原料按如下重量体积比配制 醋酸钠 3H20100 120g 柠檬酸.H2O90 IlOg 加入蒸馏水800mL 用浓盐酸调节PH至3. 0 4. 0 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液。
2.根据权利要求I所述的TMB显色体系，其特征在干， 所述TMB储存液由以下原料按如下重量体积比配制 TMB5. Og DMSO450mL 甘油50mL ； 所述TMB底物缓冲液母液由以下原料按如下重量体积比配制 醋酸钠 *3H20113. Og 柠檬酸 H2O105. Og 加入蒸馏水800mL 用浓盐酸调节PH至3. 6 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液。
3.根据权利要求I或2所述的TMB显色体系，其特征在于，按以下方法配成显色剂 ①配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液IOmL H2O2 (30%)0.30 0.40mL; 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液； ②所述TMB储存液和所述TMB底物缓冲液工作液按体积比为20 100 1000的比例混合制得TMB显色剂。
4.根据权利要求3所述的TMB显色体系，其特征在于，①配制TMB底物缓冲液工作液中加入H2O2 (30%)为0.33mL，②所述TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液按体积比为I : 50的比例混合制得TMB显色剂。
5.ー种TMB显色剂的配制方法，其特征在于包括以下步骤 ①由以下原料按如下重量体积比配制TMB储存液 TMB5. Og DMSO450mL 甘油50mL ； ②由以下原料按如下重量体积比配制TMB底物缓冲液母液 醋酸钠 3H20100 120g柠檬酸.H2O90 IlOg 加入蒸馏水800mL 用浓盐酸调节PH至3. 0 4. 0 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液； ③配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液IOmL H2O2 (30%)0.30 0.40mL; 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液； ④所述TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液按体积比为20 100 1000的比例混合制得TMB显色剂。
6.根据权利要求5所述的TMB显色剂的配制方法，其特征在于包括以下步骤 ①由以下原料按如下重量体积比配制TMB储存液 TMB5. Og DMSO450mL 甘油50mL ； ②由以下原料按如下重量体积比配制TMB底物缓冲液母液 醋酸钠 *3H20113. Og 柠檬酸 H2O105. Og 加入蒸馏水800mL 用浓盐酸调节PH至3. 6 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液母液； ③配制TMB底物缓冲液工作液 TMB底物缓冲液母液IOmL H2O2 (30%)0. 33mL ； 加入蒸馏水定容至1000 mL制得TMB底物缓冲液工作液； ④所述TMB储存液和TMB底物缓冲液工作液按体积比为I: 50的比例混合制得TMB显色剂。
全文摘要
本发明公开了一种TMB显色体系，包括TMB储存液和TMB底物缓冲液母液，所述TMB储存液由以下原料按如下重量体积比配制TMB4.5～5.2g；DMSO450mL；甘油50mL；所述TMB底物缓冲液母液由以下原料按如下重量体积比配制醋酸钠·3H2O100～120g；柠檬酸·H2O90～110g加入蒸馏水800mL，用浓盐酸调节pH至3.0～4.0；加入蒸馏水定容至1000mL制得TMB底物缓冲液母液。按以下方法配成显色剂①配制TMB底物缓冲液工作液；TMB底物缓冲液母液10mL；H2O2(30%)0.30～0.40mL；加入蒸馏水定容至1000mL制得TMB底物缓冲液工作液；②所述TMB储存液和所述TMB底物缓冲液工作液按体积比为20～100∶1000的比例混合制得TMB显色剂。
文档编号G01N33/543GK102866249SQ20121033510
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年8月15日
发明者刘晓志, 赵伟, 董向峰, 常亮, 陈雪静, 高健, 段宝玲 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司
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