枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法
技术领域：
：本发明属于果实贮藏与植物分子生物
技术领域：
，涉及枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法。
背景技术：
：枇杷(iZrijaponicaLindl.)是原产我国的蔷薇科常绿果树,属于非跃变型果实。不同于其他果实在采后软化的过程，红肉枇杷在采后贮藏过程中会出现木质化现象，造成果实硬度上升、风味变淡、粗糙少汁等，严重影响了果实品质与经济价值。05°C低温能显著抑制枇杷果实的呼吸和乙烯释放，从而延长货架期，但是在01°C会使果实发生冷害，反而会加速枇杷果实木质化的产生。程序降温(LTC)，即先将枇杷果实于5°C贮藏6天，然后再转到0°C贮藏，可以减轻冷害，减缓木质素的生成。热激处理(HT)是将果实经过400C的4h处理之后放入0°C贮藏，也可以减轻果实的木质化进程。乙烯是一种重要的植物激素，参与植物生长的整个过程,包括种子萌发、花的发育与分化、果实的成熟与衰老等过程，同时乙烯还是一种信号物质，参与植物对各种生物或是非生物(环境)胁迫的反应。在乙烯信号转导过程中，乙烯响应因子(ERF)位于信号转导途径的末端，直接诱导或是抑制目标基因的表达，并且可能顺式调控其他转录因子，从而实现乙烯的生物学效应。如在番茄中，通过抑制番茄LeERFl基因表达可有效延缓番茄果实成熟，同时LeERF2可特异调控乙烯合成基因，进而反馈调控乙烯合成。果实在低温、短时高温等逆境环境中会产生一定的防御反应，其中ERF可能是响应的基因之一,不同的逆境环境中可能有不同的ERF基因家族成员进行响应。枇杷果实低温贮藏中，ERFs家族成员调控木质化的生物学机制尚不清楚。
发明内容本发明的目的是提供一种枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法，通过以下步骤实现克隆得到乙烯响应因子(ERF)基因家族成员，以及这些成员在枇杷果实采后冷藏过程中表达量的变化情况，得到调控木质素合成有关的ERF转录因子成员，丰富枇杷果实乙烯信号转导途径的理论内容，并为果实保鲜提供新途径。本发明的具体实施步骤如下I、枇杷乙烯响应因子序列的获得根据华大公司深度测序返回的结果中，查找到与乙烯相关的Unigene约395条，其中与AP2/ERF乙烯响应因子有关的Unigene共164条。将这164条Unigene翻译的蛋白序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行蛋白序列的比对(proteinblast),筛选出含有一个完整AP2结构域的Unigene。2、乙烯响应因子3’末端序列的获得参照Clontech公司SMARTRACEcDNAAmplification试剂盒说明书，合成3’cDNA模板并根据说明书要求在http://frodo.wi.mit.edu/primer3/网站上设计相应基因的特异3’末端引物,每个基因设计两个特异引物，分别为内侧引物、外测引物，引物序列见SEQIDNO:1-32，下游引物参照试剂盒说明书提供的通用引物。对3’cDNA模板进行2次PCR，第二次PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与pMD18_T载体过夜连接,转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，用100mg/ml青霉素的LB板上筛选阳性克�。⒍陨秆〕龅难粜钥寺〗徊接迷靥逡锝芯銹CR确定后，送上海英俊公司测序。测序列结果用CLUSTALX软件与已有的Unigene进行比对，共获得32条ERF相关基因的3’末端序列。3、枇杷果实的RNA的提取采用CTAB法提取。粗提的RNA用TURBODNase(Ambion)去除其中的DNA,取IuI去DNA的RNA用NanophotometerPearl(Implen)定量后，取3Ug用RevertAidFirstStrandcDNA试剂盒(Fermentas)逆转录成cDNA,用于定量PCR。4、以冷敏性红肉枇杷洛阳青(LYQ)为材料进行以下3个处理直接0°C贮藏，热激(HT,40°C4h后转入(TC贮藏)，程序降温(LTC，5°C6d后转入(TC贮藏)。检测3个处理过程中硬度、木质素含量的变化情况。5、对筛选出的32个乙烯响应因子(ERF)用在线网站http://frodo.wi.mit.edu/primer3/设计定量PCR的引物，引物序列见SEQIDNO:33-640以枇杷管家基因Actin作为内参基因，序列参见SEQIDN0:65。处理前的起始点表达量为1，计算方法采用AACt相对定量的方法计算3个处理过程中ERF基因的表达量。6、结合红肉枇杷洛阳青果实贮藏的三个处理中((TC、热激、程序降温)的硬度、木质素含量的变化情况以及ERF基因的表达情况，筛选出2个与枇杷果实木质化进行有一定相关性的ERF基因，分别为SEQIDN0:66和SEQIDN0:67。SEQIDNO:66,SEQIDNO:67在直接0°C处理处理的果实中表达量上升，而在HT、LTC处理被抑制，与枇杷果实在3个处理中的硬度、木质素含量的变化呈显著的正相关性，SEQIDNO:66,SEQIDN0:67参与果实冷害木质化的进程，HT、LTC处理能够减轻低温时产生的冷害木质化。步骤2所述二次PCR的第一次反应参数为10XExBuffer2uL,2.5mmol/LdNTPsI.6yl，外测引物UPM2UL,10Umol/L特异外测引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.1yL,加灭菌的双蒸水至20uI,TouchdownPCR反应条件为反应条件为94°C预变性5min;94°C变性30s，72°C，150s，5个循环；94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5个循环；94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25个循环；最后72°C延伸10min。第二次反应参数为10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPsI.6UI,内测引物NUP2uL,10iimol/L特异内测引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IuL，加灭菌的双蒸水至20yL，94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s，35个循环；最后72°C延伸10min。步骤5所述的计算基因表达量的方法是以枇杷管家基因Actin作为内参基因，处理前的起始点表达量为I,计算方法采用AACt相对定量的方法。反应体系为SsoFastEvaGreensupermix10u1,10Mm的上下游引物各Iul，模板2UI,加无菌水至20uI0反应程序为95°C预变性30s;95°C变性5s，60°C退火5s，45个循环。木质化是枇杷果实采后贮藏过程中影响果实品质的重要方面，尤其是在低温环境，冷害症状的表现之一就是加快木质化的过程，1_MCP、LTC等处理可以减轻冷害木质化的产生。本发明是利用深度测序的结果，克隆到枇杷中乙烯响应因子(ERF)Unigene的3’末端核甘酸序列，一共获得到32个3’末端序列，并对这些乙烯响应因子在0°C、HT、LTC处理的枇杷果实中ERF表达量的变化，得出与冷害木质化有关的ERF基因家族成员SEQIDN0:66、SEQIDN0:67，为进一步研究其作用机制、果实采后保鲜技术提供基础理论依据。图I为0°C、HT、LTC处理后洛阳青果实硬度(A)和木质素含量(B)变化情况。图2为(TC、HT、LTC处理后洛阳SEQIDNO:66(A)和SEQIDNO:67(B)基因表达情况。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。以下实施例采用的方法与条件为I:使用SMARTRACEcDNAAmplification试剂盒获得Unigene的3’末端核甘酸序列的2次PCR过程。第一次外测引物PCR反应参数为10XExBuffer2uL,2.5mmol/LdNTPsI.6yl，外测引物UPM2uL,10ymol/L特异外测引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IUL,加灭菌的双蒸水至20uL0TouchdownPCR反应条件为反应条件为94°C预变性5min;94°C变性30s，72°C，150s’5个循环；94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5个循环；94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25个循环；最后72°C延伸10min。第二次反应参数为10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPs1.6uI,内测引物NUP2uL,10ymol/L特异内测引物0.5iiI,ExTaq聚合酶0.IUL,加灭菌的双蒸水至20uL094°C预变性5min；;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90S，35个循环；最后72°C延伸10min。2.定量PCRR的反应体系为SsoFastEvaGreensupermixIOuI，10Mm的上下游引物各Iii1，模板2uI，加无菌水至20yl。反应程序为95°C预变性30s;95°C变性5s，60°C退火5S，45个循环。实施例一枇杷ERF在程序降温(LTC)中的表达(一)实验方法I.材料处理选择大小均匀、无病虫害、无擦伤的红肉枇杷果实洛阳青(LYQ)，一批直接放入0°C贮藏，另一批进行程序降温(LTC)处理，即在5°C贮藏6天后转入0°C贮藏。2.枇杷果实硬度用质构仪(StableMicroSystems,UK)测定，每个果实分别测定果实对称面赤道部位，其平均值作为一个重复，单果重复10次。测定系数如下探头P5，穿透深度4mm,测前速度为3mms'测定速度为Imms'测后速度为10mms'最终数据用牛顿(N)表示。3.木质素含量的测定。样品的洗涤果实冻样于5mL洗液(100mM的K2HPO4/KH2PO4,0.5%TritonX-100,0.5%PVP,pH7.8)中，在室温下振荡洗涤30min,10000g，20min离心，用洗液重悬浮沉淀，重复洗两次，再用100%甲醇洗4次，每次洗的时间均为半小时，同样10000g，20min离心。沉淀在80°C烘箱中烘干过夜。木质素含量的测定精确称取IOmg的经洗涤烘干后的粉末于IOmL的带盖的管子，加入ImL的2MHCl和0.ImL的巯基乙酸，沸水浴8h后置冰上冷却，15000g，4°C离心20min;沉淀用蒸馏水清洗、过夜烘干后重悬浮于2mL的IM的NaOH中，室温下轻微振荡反应18h，再用15000g，离心20min;取0.5mL的上清液于新的试管中，加入100uL的浓盐酸，置4°C下4h以沉淀巯基乙酸结合的木质素，用15000g,4°C离心20min,沉淀溶于ImL的IM的NaOH。经过适当稀释后，用紫外-可见分光光度计测定280nm处的吸光值。以NaOH溶液为空白对照。单位为X103A280/kgFW，重复3次。4.采用CTAB法提取果实RNA，之后去除DNA污染，进行逆转录。并对获得的32个ERFUnigene进行定量PCR分析。(二)实验结果I.直接放在0°C贮藏的枇杷果实硬度快速增加，并且果肉中的木质素含量也随着快速增加，LTC处理可以有效抑制LYQ果实硬度的增加并减缓果实木质素积累(附图1A，1B)。2.SEQIDNO:66、SEQIDNO:67在(TC表达量上升，而LTC处理下表达明显被抑制。与硬度、木质素含量的变化呈显著的正相关性(附图2A，2B)。实施例二相关ERF在热激(HT)中的表达(一)实验方法(I)材料处理选择大小一致、无病虫害、擦伤的红肉枇杷果实洛阳青(LYQ)，一批直接放入0°C贮藏，另一批进行40°C的热空气处理(热激，HT)4小时后转入0°C贮藏。(2)枇杷果实硬度用质构仪(StableMicroSystems,UK)测定,木质素含量的测定(方法如上)。(3)采用CTAB法提取果实RNA，之后去除DNA污染，进行逆转录。并对获得的32个ERFUnigene进行定量PCR分析。(二)实验结果(I)HT处理与直接0°C贮藏的果实相比，果实硬度、木质素含量的增加减缓，参见附图I(A)、(B))。(2)SEQIDNO:66,SEQIDNO:67在0°C表达量上升，HT处理下这2个基因表达被抑制，参见附图2(A)、(2)。结合实施例一，表明LTC、HT可以减缓LYQ果实冷害木质化的进程，同时SEQIDNO:66,SEQIDNO:67的表达与该进程呈正相关关系，表明可能参与调控果实冷咅木质化。权利要求1.枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法，其特征在于，通过以下步骤实现(1)枇杷乙烯响应因子序列的获得根据华大公司深度测序返回的结果，一共查找到与乙烯相关的Unigene约395条，其中与AP2/ERF乙烯响应因子有关的Unigene共164条，将这164条Unigene翻译的蛋白序列在NCBI中进行蛋白序列的比对，筛选出含有AP2结构域的Unigene；(2)乙烯响应因子3’末端序列的获得参照Clontech公司SMARTRACEcDNAAmpIification试剂盒说明书,合成3’cDNA模板并根据说明书要求设计相应基因的特异3’末端引物，每个基因设计两个特异的上游引物，分别为内侧引物、外测引物，引物序列见SEQIDNO:1-32，下游引物参照试剂盒说明书提供的通用引物，对3’cDNA模板进行2次PCR，第二次PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与PMD18-T载体过夜连接，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，用100mg/ml青霉素的LB板上筛选阳性克�。⒍陨秆〕龅难粜钥寺〗徊接迷靥逡锝芯銹CR确定后测序，一共得到32条ERF相关基因的3’末端序列；(3)枇杷果实的RNA的提取采用CTAB法提取，粗提的RNA用TURBODNase去除其中的DNA,取IUI去DNA的RNA用NanophotometerPearl定量后，取3Ug用RevertAidFirstStrandcDNA试剂盒逆转录成cDNA,用于定量PCR;(4)以冷敏性红肉枇杷洛阳青为材料进行以下3个处理直接0°C贮藏；热激，即40°C4小时后转入0°C贮藏；程序降温，即5°C6天后转入0°C贮藏；检测3个处理过程中硬度、木质素含量的变化情况；(5)对筛选出的32个乙烯响应因子用在线网站http://frodo.wi.mit.edu/primer3/设计定量PCR的引物，引物序列见SEQIDN0:33-64，以枇杷管家基因Actin作为内参基因，引物序列见SEQIDN0:65，处理前的起始点表达量为1，计算方法采用AACt相对定量的方法计算3个处理过程中ERF基因的表达量；(6)结合红肉枇杷洛阳青果实贮藏的三个处理中((TC、热激、程序降温)的硬度、木质素含量的变化情况以及ERF基因的表达情况，筛选出2个与枇杷果实木质化进行有一定相关性的ERF基因，分别为SEQIDN0:66和SEQIDN0:67。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述二次PCR的第一次反应参数%10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPsI.6iil，外测引物UPM2yL，10ymol/L特异外测引物0.5iiI,ExTaq聚合酶0.IUL,加灭菌的双蒸水至20iiL,TouchdownPCR反应条件为反应条件为94°C预变性5min;94°C变性30S，72°C，150s，5个循环；94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5个循环；94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25个循环；最后72°C延伸10min；第二次反应参数为10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPs1.6UI,内测引物NUP2iiL，10iimol/L特异内测引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IUL，加灭菌的双蒸水至20UL,94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90S，35个循环；最后72°C延伸10min。3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的计算基因表达量的方法是以枇杷管家基因Actin作为内参基因，处理前的起始点表达量为1，计算方法采用AACt相对定量的方法；反应体系为SsoFastEvaGreensupermix10uI,10Mm的上下游引物各IU1，模板2iU，加无菌水至20iU;反应程序为95°C预变性30s;95°C变性5s，60°C退火5S，45个循环。全文摘要本发明提供一种枇杷中与木质素代谢相关的乙烯响应因子克隆与转录调控方法，通过从枇杷深度测序的结果中获得乙烯响应因子(ERF)序列片段，乙烯响应因子(ERF)3’末端序列的获得，乙烯响应因子(ERF)在木质素合成代谢中的转录调控方法。本发明利用深度测序的结果，克隆到枇杷中乙烯响应因子(ERF)Unigene的3’末端核甘酸序列，一共获得到32个3’末端序列，并对这些乙烯响应因子在0℃、HT、LTC处理的枇杷果实中ERF表达量的变化，得出与冷害木质化有关的2个ERF基因家族成员，为进一步研究其作用机制、果实采后保鲜技术提供基础理论依据。文档编号G01N21/64GK102747068SQ201210195408公开日2012年10月24日申请日期2012年6月14日优先权日2012年6月14日发明者孙崇德,徐倩,殷学仁,闵婷,陈昆松申请人:浙江大学

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枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法