专利名称：一种基于表面增强拉曼光谱的人乳腺癌细胞mcf-7的特异性检测方法
技术领域：
本发明属于细胞检测方法技术领域，涉及一种人乳腺癌细胞MCF-7的检测方法， 具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱特异性检测人乳腺癌细胞MCF-7的方法，是一种灵敏度高、特异性强的人乳腺癌细胞MCF-7的检测方法。
背景技术：
癌症是导致人类死亡的一种重要原因，据世界卫生组织统计，每年约有700万人死于各类癌症疾病。在女性当中，乳腺癌是一种发病率最高的癌症疾�。医昀慈橄侔┑姆⒉÷食拭飨陨仙魇疲�2008年全球乳腺癌的发病率高达41. 4%。乳腺癌的早期诊断和治疗对于降低乳腺癌死亡率，提高疾病患者5年存活率具有极其重要的意义。癌症是一种控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，其发生与发展与细胞的状态密切相关。在各类癌症疾病中，癌细胞的生长与分裂速度远远超过正常细胞，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。因此，发展一种可靠的、灵敏的检测人乳腺癌细胞的方法对于实现乳腺癌的早期诊断、筛查及预后意义重大。在当前的乳腺癌医学诊断方法中，影像技术是一种最为常见的有效方法。但是影像技术也有其明显的不足，如难以分辨一些病理性特征相同或相近的癌细胞，难以灵敏的检测到癌症早期癌细胞水平较低时的癌变细胞等。而提高检测的特异性及灵敏度对于癌症的早期诊断治疗作用重大，因此越来越多的工作倾向于从单细胞、单分子水平上对癌细胞进行检测。目前对单细胞研究的技术主要包括荧光光谱技术、扫描探针显微技术、微流控技术、毛细管电泳技术等，但大多数技术存在侵入性，会对细胞产生破坏。光学技术具有无侵入、无电离辐射、允许多种模式成像、可获得实时与定量等多种信息的特点，在生命科学研究中占有越来越重要的地位。目前已经在生物医学领域中得到应用的光谱技术主要有紫外可见吸收光谱、红外光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。拉曼光谱与其它光谱相比具有一些突出的优点，如稳定性高、不易猝灭、可用红光激发、对生物样品损坏小、不受生物样品自身荧光及水的干扰等，因而尤其适合于细胞样品的研究。提高拉曼光谱方法的靶向性对于提高检测的特异性和灵敏度十分重要。癌细胞的细胞膜表面通常具有一些与正常细胞不同的蛋白或者糖基(物种或者浓度)，常用的标志物包括表皮生长因子受体、磷酸酶及叶酸受体等。适体(aptamer)是用配体指数富集法系统演化(SELEX)技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列，可以与蛋白质甚至整个细胞发生特异性结合作用。将癌细胞标志物的核酸适体进行表面增强拉曼的功能化并与癌细胞相互作用，可实现基于表面增强拉曼光谱的高灵敏度、高特异性的癌细胞靶向检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼光谱的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，制备一种表面增强拉曼光谱功能化的乳腺癌MCF-7细胞适体复合材料 (Au-Ag-aptamer),该纳米复合材料具有强的表面拉曼增强作用，由于适体和细胞表面标志物间强的专一'I"生作用，基于所述纳米复合材料制成探针复合物(Rh 6G-Au-Ag-aptamer) 对人乳腺癌细胞MCF-7有高度的选择性，从而实现基于表面增强拉曼光谱的乳腺癌细胞 MCF-7的高灵敏度、高特异性检测。本发明利用光催化的方法对人乳腺癌MCF-7细胞适体进行功能化，在适体核酸链上沉积金和银的双金属合金纳米粒子(Au-Ag NPs)，并修饰上拉曼信号分子罗丹明6G (Rh 6G)，制备得到MCF-7细胞拉曼光谱检测的分子探针，利用适体与MCF-7细胞的特异性靶向结合能力及适体表面的金/银双金属合金纳米粒子对Rh 6G分子拉曼信号的增强作用，对 MCF-7细胞的进行高灵敏度的特异性检测。完成上述发明任务的技术方案是
一种基于表面增强拉曼光谱的的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，包括以下步
骤
a)Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物的合成将核酸适体(S2. 2，序列为5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G - 3’)溶解在磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7. 4)中，在其中加入一定体积比的NaAuCl4和AgNO3溶液(体积比I飞I )，混合并搅拌均匀，在暗处4 °C下放置12 小时以上,置于紫外灯下光照5 min至60 min,形成Au-Ag-aptamer纳米复合物；将罗丹明 6G (Rh 6G)溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，避光搅拌后离心处理，用PBS 洗漆除去未吸附的Rh 6G分子,得到探针复合物,标记为Rh 6G-Au-Ag-aptamer。b)Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物与细胞作用将步骤a)制得的纳米探针复合物分散成均相溶液，加入到MCF-7细胞中，在室温下孵育后，用PBS洗涤细胞除去未和细胞作用的探针复合物。c)拉曼光谱检测MCF-7细胞将上述步骤b)中和探针复合物作用后的细胞用胰蛋白酶溶液消解，用PBS溶液制得细胞悬液，将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，采用表面增强拉曼光谱方法检测MCF-7细胞。所述的步骤a)中，Rh 6G-Au_Ag-aptamer纳米探针复合物的制备具体包括以下步骤
1)将核酸适体(S2.2，序列为 5，-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. I mo I/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)溶解，浓度为300 ng/mL ；
2)将一定量的NaAuCl4(lmmol/L)和AgNO3 (lmmol/L)溶液按一定体积比混合(体积比f 5 :1)，将混合液加入到I)所述的核酸适体溶液中，其中Ag+与适体碱基的物质量比为 1: 5，在4°C下连续搅拌O. 5 - 2小时，并在暗处避光保存12h以上，使Au3+和Ag+吸附到适体的碱基上，得到Au3+-Ag+-aptamer复合物；
3)将Au3+-Ag+-aptamer复合物(放置到石英比色皿中)在波数为254nm的紫外灯下光照5min-60min,溶液颜色由无色逐渐变为蓝色,得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；
4 )将Rh 6G溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为14 11101/1的，在41下避光搅拌lh，离心处理后(转速为10000转/分，时间10 min)用O. I mo I/L PBS溶液(pH 7. 4)洗涤去除未吸附的Rh 6G分子，得到所述的Rh 6G-Au-Ag-aptamer 探针复合物。所述的步骤b)中，Rh 6G-Au-Ag_aptamer探针复合物与细胞作用的方法是将所述Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在PBS溶液中(pH 7. 4)中分散，浓度为O. lmg/mL,取 100 μ L加入到ImL MCF-7细胞的悬浮液中(细胞个数为I X IO5个/mL)，在室温下孵育30 min,依次用PBS溶液洗涤细胞3_5次，去除未和细胞作用的探针复合物。所述的步骤c)中，拉曼光谱检测MCF-7细胞的方法为在所述步骤b)中得到的与探针复合物作用后的细胞中，加入I mL O. 25%的胰蛋白酶，室温下消化3 min，在1000转/ 分下离心10 min，去除上清液，加入I mL PBS，使其形成均匀的细胞悬液，取10 μ L该细胞悬液，将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，避光保存，采用表面增强拉曼光谱法检测MCF-7 细胞，检测波长为785 nm，检测波数范围为400-4000 cnT1，采集时间为10 S。本领域技术人员不难理解，由扫描得到的表面增强拉曼光谱，根据其特征峰及强度，可对MCF-7细胞进行定性或定量检测。核酸适体S2. 2与MCF-7细胞具有特异性靶向结合能力，有关核酸适体S2. 2可参见 C. Yu, Y. Hu, J. H. Duan, ff. Yuan, C. Tang, H. Y. Xu, X. D. Yang, Plos One, 2011， 6，e24077。所述的探针复合物具有高度的与人乳腺癌细胞MCF-7的靶向结合能力，及高的表面增强拉曼活性。该探针复合物的表面增强拉曼光谱上存在罗丹明分子的特征吸收峰。因此，按照本发明方法制得的Rh 6G-Au-Ag_aptamer复合物在透射电镜图上典型地呈DNA链状分布，与细胞作用后，对细胞的表面进行表面增强拉曼光谱检测，图谱上出现明显的信号分子Rh 6G的特征拉曼信号峰。本发明具有以下优点本发明的基于表面增强拉曼光谱的人乳腺癌MCF-7细胞的检测方法，所采用的Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米复合物的探针对MCF-7细胞有高的特异性识别能力和拉曼信号增强能力，通过对拉曼信号的监测实现对MCF-7癌细胞的检测，该检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点，在生理学、病理学、临床学的研究中具有重要意义。
图I Au-Ag-aptamer纳米复合物的透射电镜图。图2 Rh 6G-Au-Ag-aptamer复合物探针与MCF-7细胞作用前(a)后(b)的细胞的突光照片。图3基于探针复合物表面增强拉曼信号的人乳腺癌MCF-7细胞的拉曼光谱图。
具体实施例方式实施例I
将核酸适体(S2. 2，序列为 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. I mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)溶解，浓度为 300 ng/mL ;将 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/ L八8勵3溶液按体积比为1:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au3+、Ag+及碱基的物质量比为1:1:5，将该混合液在4°C下连续搅拌O. 5 - 2小时，并在暗处避光保存12h,将其转移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min, 得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置O. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到 Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为I μ mol/L的,在4°C下避光搅拌lh，以10000转/分的转速离心10 min，用O. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗涤沉淀共 3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探针复合物,TEM照片显示所得的复合物呈链状分布，粒径均一，约为20 nm。实施例2
将核酸适体(S2. 2，序列为 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 O. I mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)溶解，浓度为 300 ng/mL ;将 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/ L AgNO3溶液按体积比为2:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au3+、Ag+ 及碱基的物质量比为2:1:5，将该混合液在4°C下连续搅拌0. 5 - 2小时，并在暗处避光保存12h,将其转移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min, 得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置0. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到 Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为I μ mol/L的,在4°C下避光搅拌lh，以10000转/分的转速离心10 min，用0. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗涤沉淀共 3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探针复合物,TEM照片显示所得的复合物呈链状分布，粒径均一，约为40 nm。实施例3
将核酸适体(S2. 2，序列为 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3，)用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)溶解，浓度为 300 ng/mL ;将 lmol/L 的 NaAuCl4 和 Imol/ L AgNO3溶液按体积比为4:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au3+、Ag+ 及碱基的物质量比为4:1:5，将该混合液在4°C下连续搅拌0. 5 - 2小时，并在暗处避光保存12h,将其转移至IcmXlcm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min, 得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置0. I mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到 Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为I μ mol/L的,在4°C下避光搅拌lh，以10000转/分的转速离心10 min，用0. I mol/L PBS溶液(pH 7. 4)洗涤沉淀共 3遍,去除未吸附的Rh 6G分子,得到Rh 6G-Au_Ag-aptamer探针复合物,TEM照片显示所得的化合物呈链状分布，粒径均一，约为100 nm。实施例4
将实施例3制备的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物与MCF-7细胞作用，利用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞。首先培养MCF-7细胞将MCF-7细胞贴壁生长于DMEM (Dulbecco，s modified Eagle medium)培养液中，其中含牛胚胎血清10%(v/v)、青霉素100 U/mL、链霉素100 μ g/ mL，在37°C、5%的培养箱中培养。观察细胞生长，当细胞长到90%左右使进行传代。传代时， 去除培养液，用PBS溶液洗涤3次，加入I mL 0.25%的胰蛋白酶37 °C恒温消化3min，取适量细胞悬液加入新培养基中继续培养，隔天换液，用细胞计数器控制细胞个数在IX IO5个/ mL,除去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，细胞待用。将实施例3中所制备的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在PBS溶液中(pH 7. 4)中分散，浓度为O. lmg/mL，取100 μ L分散液加入到I X IO5个MCF-7细胞中，在室温下孵育 30 min，用吸管吸去未和细胞作用的探针复合物，并用3 mL PBS溶液洗涤细胞3_5次。将和探针复合物作用后的细胞用I mL O. 25%的胰蛋白酶在室温下消化3 min,以 1000转/分离心10 min后，去除上清液，再加入I mL PBS溶液，使其形成均匀的细胞悬液， 取10 μ L该细胞悬液将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，采用表面增强拉曼光谱技术检测 MCF-7细胞，检测波长为785 nm，波数范围400-4000 cnT1，采集时间为10 S。使用共聚焦显微拉曼光谱仪测量样品的拉曼光谱，在法国Jobin Yvon公司的 Labram HR800激光拉曼光谱仪上进行。由CXD进行信号接受和光电转换。以德国PILOT公司的Sacher laser technik固体红外激光器作光源,激发波长785nm,狭缝宽200 μ m,取谱时间10s，在50X物镜下测量样品的拉曼信号，激光经过显微系统聚焦后，光斑直径大小为 I μ m，拉曼光谱取谱范围为400-18000^1,对每条光谱的原始数据通过软件进行多项式拟合扣除荧光背景，从而获取SERS光谱。实验结果表明，MCF-7细胞的拉曼光谱图(图3)上出现明显的拉曼信号分子Rh 6G 的拉曼峰。得到的MCF-7细胞的SERS光谱图上(a)，出现了标记物罗丹明6G分子(Rh6G)的特征吸收峰，C-C-C环平面振动吸收峰(610 cm-1), C-H非平面弯曲振动吸收峰(771 cnT O，C-H 平面振动峰(1127 和 1184 cnT O，N - H 平面振动峰(1307 and 1575 cnf1)， 和C-C伸缩振动峰(1362，1510，and 1650 cnf1)。而对照组的正常乳腺细胞MCF-10A 细胞(b)和肝癌细胞HepG2细胞表面的SERS光谱图(c)上未出现任何Rh6G的特征峰，说明基于Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米复合物的探针对MCF-7细胞有高的特异性识别能力，从而通过拉曼信号分子的Rh6G分子的特征拉曼峰，实现对MCF-7癌细胞的表面增强拉曼检测。实施例5
将实施例1、2制备得到的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在与实施例4相同的条件下与MCF-7细胞作用，利用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞。实验结果表明它们拉曼光谱图上也能够得到特征峰位置相似，但强度稍弱的Rh 6G的拉曼信号。
权利要求
1.一种基于表面增强拉曼光谱的的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，包括以下步骤a)Rh 6G-Au-Ag-aptamer 探针复合物的合成将序列为 5’ -GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3’的核酸适体S2. 2，溶解在磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7. 4)中，加入体积比I飞1的NaAuCl4和AgNO3溶液，混合并搅拌均匀，在暗处4 °C下放置12小时以上，置于紫外灯下光照5 min至60 min,形成Au-Ag-aptamer纳米复合物；将Rh 6G溶液加入到 Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，避光搅拌后离心处理，用PBS洗涤除去未吸附的Rh 6G分子,得到探针复合物,标记为Rh 6G-Au-Ag-aptamer ；b)Rh6G-Au-Ag-aptamer探针复合物与细胞作用将步骤a)制得的纳米探针复合物分散成均相溶液，加入到MCF-7细胞中，在室温下孵育后，用PBS洗涤细胞除去未和细胞作用的探针复合物；c)拉曼光谱检测MCF-7细胞将上述步骤b)中和探针复合物作用后的细胞用胰蛋白酶溶液消解，用PBS溶液制得细胞悬液，将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，采用表面增强拉曼光谱方法检测MCF-7细胞。
2.根据权利要求I所述的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，其特征在于，所述的步骤a)中，Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米探针复合物的制备,包括以下步骤.1)将序列为5，-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G - 3，的核酸适体 S2. 2，用 O. I mo I/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)溶解，浓度为300 ng/mL ；.2)将一定量的lmol/L NaAuCl4和lmol/L AgNO3溶液按体积比广5 1混合，将混合液加入到步骤I)中的核酸适体溶液中，其中Ag+与适体碱基的物质量比为1:5，在41下连续搅拌O. 5 - 2小时，并在暗处避光保存12h以上，使Au3+和Ag+吸附到核酸适体的碱基上，得到 Au3+-Ag+_aptamer 复合物；.3)将Au3+-Ag+-aptamer复合物在波数为254nm的紫外灯下光照5min-60min,溶液颜色由无色逐渐变为蓝色，得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；.4)将Rh6G溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为lymol/L，在4°C下避光搅拌lh，离心处理后用O. I mo I/L PBS溶液(pH 7. 4)洗涤去除未吸附的Rh 6G分子,得到所述的探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer。
3.根据权利要求I所述的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，其特征在于，所述的步骤b)中，探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer与人乳腺癌细胞MCF-7的作用方法为将所述Rh 6G-Au-Ag-aptamer复合物探针在PBS溶液中(pH 7. 4)中分散，浓度为0. lmg/mL,取 100 μ L加入到ImL细胞个数为I X IO5个/mL的MCF-7细胞的悬浮液中，在室温下孵育30 min，用PBS溶液洗涤3_5次去除未和细胞作用的探针化合物。
4.根据权利要求I所述的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，其特征在于，所述的步骤c)中，拉曼光谱检测MCF-7细胞的方法为在步骤b)得到的与探针复合物作用后的细胞中，加入I mL 0. 25%的胰蛋白酶，室温下消化3 min，在1000转/分下离心10 min，去除上清液，加入I mL PBS，使其形成均匀的细胞悬液，取10 μ L该细胞悬液，将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，避光保存，采用表面增强拉曼光谱方法检测MCF-7细胞，检测波长为 785 nm，范围 400—.4000 cnT1，采集时间为 10 S。
全文摘要
一种基于表面增强拉曼光谱的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性检测方法，将MCF-7细胞和探针复合物Rh6G-Au-Ag-aptamer作用，其拉曼光谱出现Rh6G的特征吸收峰，采用表面增强拉曼光谱方法检测MCF-7细胞。所述的探针复合物以核酸适体S2.2为模板，采用光催化方法，在其DNA链的碱基上沉积金和银的双金属合金纳米粒子，并在其表面固载拉曼信号分子Rh6G制得。该方法基于和MCF-7细胞靶向结合且具有高的表面增强拉曼活性的探针复合物，利用适体与MCF-7细胞的特异性靶向结合能力及适体表面的合金纳米粒子对Rh6G分子拉曼信号的增强作用，对MCF-7细胞的进行特异性检测。
文档编号G01N21/65GK102608102SQ20121008048
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月24日 优先权日2012年3月24日
发明者吴萍, 张卉, 蔡称心 申请人:南京师范大学
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