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专利名称：直接检测人基质细胞衍生因子-1(sdf-1)活性的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒。
背景技术：
SDF-I又称为CXCL12，是趋化因子蛋白家族的一员，在炎症、肿瘤和其他的恶性病变中SDF-I常作为特异性生物指标进行临床诊断，因此，能高效、灵敏的检测出SDF-I活性在科研和临床诊断过程中都有极其重要的意义。检测SDF-I活性的方法主要是免疫学方法，包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫组化法、免疫印迹法(WB)等。各种方法均存在一定的优缺点，应根据实验目的选择相应的实验方法。使用直接ELISA检测SDF-I活性具有高效、灵敏、一次可检测多个样品等优点。目前市售检测SDF-I活性的ELISA试剂盒，主要是国外知名品牌如R&D，其价格极其昂贵，严重影响了试剂盒产品在科研和生产中的广泛应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种发明快速、简便地检测SDF-I活性的ELISA试剂盒，其既能快速高效的检测出SDF-1，又能降低成本，更好地服务于科研和生产。本发明所提供的一种直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，其特性在于该试剂盒通过如下步骤检测SDF-I活性(1)包被目的蛋白SDF-I于酶标板上；(2)使用封闭液进行封闭化处理；(3)加入抗SDF-I抗体(一抗)，进行一抗抗体反应；(4)去除多余的抗SDF-I抗体(一抗)后，加入酶标抗抗体(二抗)，进行二抗抗体反应；(5)去除多余的酶标抗抗体(二抗)后，加入显色液进行显色反应；
(6)加入终止液进行终止反应；(7)在酶标板上检测OD值，根据OD值的大小判断SDF-I的活性。所述试剂盒为以蛋白作为底物检测酶活性的ELISA试剂盒。所述酶标板为96孔酶标板。所述封闭液为2%的明胶。所述一抗抗体反应为在37°C情况下孵育lhr。所述二抗抗体反应为在37°C情况下孵育Ihr。所述显色液为TMB。所述终止液为&S04，其摩尔浓度为2M。本发明所提供的ELISA试剂盒可高效、灵敏、直接检测人基质细胞衍生因子-1 (SDF-I)活性，在实际使用过程中一次可检测多个SDF-I样品。
具体的产品制备方案包括了表达包被SDF-1、封闭化处理、SDF-I抗体反应，酶标抗抗体反应，加底物显色和终止，OD值测定等步骤。首先在酶标板上包被待检样品，使用封闭液封闭化处理后；再加入适当的抗SDF-I抗体，当抗体与SDF-I充分结合后，去除多余的抗SDF-I抗体；再加入相应的酶标抗抗体，当二抗与一抗充分结合后，去除多余的二抗；再加入相应的显色液，当颜色明显变化时，加入终止液进行终止；在酶标仪上测出OD值，根据 OD值大小来判断SDF-I的活性。
具体实施例方式实施例1、包被 SDF-I 将目的蛋白SDF-I，以3000nM浓度开始包被在96孔酶标板上，按1 3的比例依次被比稀释(稀释液使用PBS)，形成10个不同浓度的样品梯度，同时以PBS代替样品，作为空白对照，100 μ 1/孔，每个浓度做两个重复。4°C过夜。使用PBST (PBS+0. 5%。吐温20)洗涤3次，每次静置5min。最后一次拍干。2、封闭化处理新鲜配制2%的明胶(用PBS配制)，300μ1/孔，在37°C情况下孵育2hr。使用PBST洗涤3次，每次静置5min ；最后一次拍干。3、SDF-I 抗体反应将抗SDF-I 的山羊多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)用 PBS 按 1 500稀释，100 μ 1/孔，在37°C情况下孵育Ihr。使用PBST洗涤3次，每次静置5min ；最后一次拍干。4、酶标抗抗体反应将辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊多克隆抗体(河南碧云天动物药业有限公司) 用PBS按1 500稀释，100 μ 1/孔，在37°C情况下孵育Ihr。使用PBST洗涤3次，每次静置5min ；最后一次拍干。5加底物显色和终止加显色液TMB (河南碧云天动物药业有限公司)200 μ 1/孔，避光，5min左右观察溶液颜色明显变蓝后，加2M的H2SO4, 50 μ 1/孔，终止反应。6、OD 值测定立即终止反应后用BioTek的Synergy HT酶标仪检测吸光度OD45tl,使用数据分析和作图软件(Graphpad Prism)分析处理OD45tl的数值从而检测SDF-I样品活性。ELISA试剂盒分析SDF-I样品活性的数据结果见附图
。
权利要求
1.一种直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，其特性在于该试剂盒通过如下步骤检测SDF-I活性(1)包被目的蛋白SDF-I于酶标板上；(2)使用封闭液进行封闭化处理；(3)加入抗SDF-I抗体(一抗)，进行一抗抗体反应；(4)去除多余的抗SDF-I抗体(一抗)后，加入酶标抗抗体(二抗)，进行二抗抗体反应；(5)去除多余的酶标抗抗体(二抗)后，加入显色液进行显色反应；(6)加入终止液进行终止反应；(7)在酶标板上检测OD值，根据OD值的大小判断SDF-I的活性。
2.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述试剂盒为以蛋白作为底物检测酶活性的ELISA试剂盒。
3.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述酶标板为96孔酶标板。
4.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述封闭液为2%的明胶。
5.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述一抗抗体反应为在37°C情况下孵育Ihr。
6.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述二抗抗体反应为在37°C情况下孵育Ihr。
7.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述显色液为TMB。
8.如权利要求1所述的直接检测人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)活性的ELISA试剂盒，特征在于所述所述终止液为H2S04。
全文摘要
本发明涉及直接检测人基质细胞衍生因子-1(SDF-1)活性的ELISA试剂盒。其通过如下步骤检测SDF-1活性在酶标板上包被SDF-1，使用封闭液封闭化处理后，加入适当的抗SDF-1抗体和相应的二抗，并再加入相应的显色液，当颜色明显变化时，加入终止液进行终止，在酶标仪上测出OD值，根据OD值的大小判断SDF-1的活性。该ELISA试剂盒可快速、简便得直接检测SDF-1活性，在实际使用过程中一次可检测多个SDF-1样品。图为SDF-1beta ELISA活性检测反应图，SDF-1beta最高浓度为3000nM，最低为0.15nM，EC50为80nM。
文档编号G01N33/543GK102183654SQ20111000657
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者卢守英, 朱月珍, 杨宣武, 柴笑梅, 江永海 申请人:江苏普罗赛生物技术有限公司