一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法，属于化学定量分析技术领域。
背景技术：
顾复昌等[参考文献1]人用双缩脲法测定了蓖麻毒蛋白含量。赵丹[参考文献 2]经硫酸铵盐析、亲和层析和凝胶过滤，得到了纯的蓖麻毒蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。双缩脲法很复杂、繁琐。提纯后再用考马斯亮蓝法测定蓖麻毒蛋白含量，提纯过程中物质损失很大，考马斯亮蓝法测定蛋白含量比较粗放，数据和实际含量差距大。金汝城等[参考文献3]和高宝岩[参考文献4]将蓖麻籽脱壳后脱脂，冰浴下在磷酸缓冲溶液中搅拌提�。昧蛩犸С恋淼玫奖吐榇值鞍祝舛ú⒓扑闩ǘ龋ü暇厶� G-200或kpharose 4B分离纯化蓖麻毒蛋白，用高效液相色谱法确定蓖麻毒蛋白，之后计算蓖麻毒蛋白含量。单纯用高效液相色谱法，一般只能进行定性鉴定，精确定量很难做到。在用葡聚糖 G-200或kpharose 4B分离纯化蓖麻毒蛋白的过程中，毒蛋白损失很大，所以数据测定粗放。参考文献[1]顾复昌，彭泳芳.蓖麻籽粕毒蛋白及非毒蛋白含量的测定.中国油料，1980，1 63-64 ；[2]赵丹.蓖麻毒蛋白的提纯及杀虫效果研究[硕].长沙湖南农业大学，2005 ；[3]金汝城，贾超，杨晓华等.蓖麻毒蛋白的分离纯化及其对南方根结线虫杀灭效果的研究.中国医药生物技术，2008，3 (4) =293-296 ；[4]高宝岩.蓖麻毒蛋白的提取及分析.光谱实验室，2001，18 ) =429-431 ；[5]曾佑炜，宋光泉，彭永宏等.蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究.中国农学通报，2004，2(K4) :23-26 ；

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法。一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法，包括以下步骤A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，测定蓖麻粗蛋白含量；A3，测定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步骤A31-A34 A31，用样品的粗蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到样品粗蛋白的SDS-PAGE电泳结果；A32，采用质谱法，对每条泳道的蛋白进行确定，确定分子量为32. Okb和34. Okb的两条带为蓖麻毒蛋白条带；A33，利用BandScan蛋白定量分析软件，对9个蓖麻样品粗蛋白电泳结果进行泳道分析；
A34，毒蛋白含量计算。采用质谱法确定分子量为32. Okb和34. Okb的两条带为蓖麻毒蛋白条带之后，不用每次都进行测定。以后可以用此方法对大量样品进行简单、快速、精确测定蓖麻种子中的毒蛋白含量，既节省时间，测定的数据又更接近实际含量。

图1为蛋白质标准曲线图2为9个蓖麻样品粗蛋白电泳图注M 低分子量标准蛋白质1 :1号样品2 2号样品3 3号样品4 4号样品5 5号样品6 6号样品7 7号样品8 8号样品9 9号样品图3为对9个蓖麻样品粗蛋白电泳结果进行泳道分析。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。利用磷酸盐法、BCA试剂盒法、UVwin5紫外软件V5. 1. 0, SDS-PAGE电泳、BandScan 蛋白定量分析软件、质谱法相结合，优化出一个简单、快速、精确测定蓖麻毒蛋白含量的方法。具体操作方法如下1. 1蓖麻粗蛋白的提取(磷酸盐法)每个样品称取50. Og去壳蓖麻籽，在液氮中充分研磨；加入5mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH6. 5，含lOOmmol/LNaCl，称为缓冲液A) 200ml并充分混勻；4°C放置过夜；4°C下 20000g离心30min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清；重复离心一次，取上清；在上清中加入固体(MM)2SO4，达到60%饱和度；4°C放置3h ；4°C下20000g离心30min ；倒去上清，把沉淀溶解在缓冲液A中；装入透析袋(MW :8000-14000)，用PEG (分子量20000)包埋后4°C透析池；4°C下20000g离心30min，取上清即为毒蛋白粗品，记录所得的粗蛋白的体积。设3 个重复。1. 2蓖麻粗蛋白含量的测定(BCA试剂盒法、UVwin5紫外软件V5. 1. 0)1.2. 1标准曲线的制作操作步骤参照北京庄盟国际生物基因科技有限公司BCA蛋白定量试剂盒说明。数据采集和标准曲线的绘制采用UVwin5紫外软件V5. 1. 0软件。利用BCA法绘制的蛋白标准曲线见图1，图1中公式C = klx (Abs)+k0 ；校正方法浓度法；k0 -0. 08091 ；kl :0. 98279 ；R2 0. 9997 ；测量波长562. Onm ；1.2. 2粗蛋白浓度测定取一定量粗蛋白，稀释100倍后测Abs(UgAil)，并根据蛋白标准曲线公式计算稀释100倍后每个样品的粗蛋白浓度(ug/ul)。1.2. 3粗蛋白含量的计算根据粗蛋白的浓度、粗蛋白的体积和每个样品提取粗蛋白时的种子用量，计算出每个样品每克种子中粗蛋白的含量。不同蓖麻样品粗蛋白含量测定，结果见表1。表1不同蓖麻样品粗蛋白含量测定结果
权利要求
1. 一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤:A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，测定蓖麻粗蛋白含量；A3，测定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步骤A31-A34 A31，用样品的粗蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到样品粗蛋白的SDS-PAGE电泳结果； A32，采用质谱法，对每条泳道的蛋白进行确定，确定分子量为32. 01Λ和34. Okb的两条带为蓖麻毒蛋白条带；A33，利用BandScan蛋白定量分析软件，对9个蓖麻样品粗蛋白电泳结果进行泳道分析；A34，毒蛋白含量计算。
全文摘要
本发明公开了一种测定蓖麻毒蛋白含量的方法，包括以下步骤A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，测定蓖麻粗蛋白含量；A3，测定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步骤A31-A34A31，用样品的粗蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到样品粗蛋白的SDS-PAGE电泳结果；A32，采用质谱法，对每条泳道的蛋白进行确定，确定分子量为32.0kb和34.0kb的两条带为蓖麻毒蛋白条带；A33，利用BandScan蛋白定量分析软件，对9个蓖麻样品粗蛋白电泳结果进行泳道分析；A34，毒蛋白含量计算。本发明的方法既节省时间，测定的数据又更接近实际含量。
文档编号G01N27/62GK102411027SQ20111021759
公开日2012年4月11日申请日期2011年8月1日优先权日2011年8月1日
发明者刘鹏, 孟凡娟, 李久明, 李国瑞, 狄建军, 苏亚拉图, 陈永胜, 魏永春, 黄凤兰申请人:内蒙古民族大学

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