专利名称：一种β-雌二醇模拟抗体的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种β-雌二醇模拟抗体的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别β-雌二醇的高效模拟抗体与研制可以快速检测β-雌二醇残留的免疫速测试剂盒的用途。
背景技术：
β-雌二醇(β-estradiol，β-E2，以下简称E2)为白色或乳白色晶体粉末，无臭，易溶于二氧六环或丙酮，微溶于乙醇，不溶于水。其分子式为C18H24O2，摩尔质量为272.39g/mol，熔点为173 179°C，E2在动物和人体内合成，具有内源性激素的活性，对人类和动物的影响是通过模拟、干扰或对抗机体内生荷尔蒙原有的正�：铣�、运输、释放和作用，使其无法维持自身的平衡和调节来实现E2对生物的�：Γ运锞佣啵饕硐衷诙陨诚低车挠跋欤傻贾律锾逯新鸦频鞍自暮铣杉铀伲云鞴俦湟欤鱿侄锎菩曰窒蟆Ｕ馐且蛭狤2能够对与生殖有关的类固醇合成过程中的酶起到抑制作用，使类固醇的合成受到阻碍。Irwin等发现，受E2影响的雌性海龟体内的卵黄蛋白原水平明显提高，并且认为可通过改变能量分配、生理或产卵以导致海龟生殖某种程度上的损害。Colucci等认为E2造成了野生鱼类的生殖畸形，Purdom等认为鱼类的雌雄同体也是与E2相关联的。此外，E2可通过饮食、空气吸入和皮肤接触等途径侵入人体，对人类的直接�：κ歉扇拍诜置谏诚低车恼９δ埽斐赡行陨芰� 的下降甚至丧失。Peterson等认为，男性精子数量的下降，睾丸癌、前列腺癌和乳腺癌发病率的增加以及男性生殖障碍都与E2有直接联系。Rajapakse等也认为男性精子数量的减少是受E2的影响。可见E2来源广泛、�：螅虼诵枰⒁惶卓焖偌虮�、科学灵敏的检测及筛检方法。核糖体展示技术(ribosome display, RD)是一种体外展示技术,基因型(DNA序列)和表型(蛋白质)可以联系起来，即将可扩增的基因组信息DNA或RNA与可选择的突变体蛋白质联系在一起。RD技术中mRNA缺乏终止密码子并经过适当修饰，在体外翻译过程中核糖体会停留在mRNA的3'末端，形成十分稳定的“mRNA-核糖体-蛋白质”三元复合物，这种三元复合体形式将蛋白质和mRNA信息连接到一起，应用RD可进行特殊功能的肽和蛋白质筛选。Lipocalin是从细菌到人都含有的一组胞外亲脂蛋白的总称，作为受体较强的结合小分子具有重要的生物学功能。尽管Iipocalin在一级结构上存在多样性，但其二级结构与四级结构却惊人的相似:由8条反相平行的β折叠片与一个α螺旋扭曲形成一个桶状结构，形成了 “Lipocalin支架”结构，含有一个配体结合位点，桶的开口端由连接β条带的多个Loop组成，是整个分子比较柔韧的部分，且氨基酸成员为极性氨基酸，LoopULoop2,Loop3,Loop4是其随机突变的区域，最近研究表明，通过改造Lipocalin骨架作为特异性配体可以结合特定祀标，亦即通过设计lipocalin的支架可模拟抗体与小分子结合，这些设计的lipocalin突变体称为Anticalin,具有配体特异性。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种潜在的检测用雌二醇模拟抗体。本发明的第二个目的提供一种雌二醇模拟抗体的制备方法。本发明的技术方案概述如下:本发明提供的抗雌二醇模拟抗体是从核糖体展示anticalin模拟抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。本发明提供的抗雌二醇模拟抗体的制备方法为:1.核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein, bbp)作为anticalin库的模板，设计随机突变位点，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Anticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、莖环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库，该库转录后的RNA分子包括一个5’ -loop和3’ -loop莖环结构，一个核糖体结合位点，随机突变的anticalin库，C末端间隔序列等,全长约950bp。其中突变库的模板可以是其他lipocalin分子,优选bbp。2.抗雌二醇模拟抗体的筛选将构建的核糖体展示anticalin模拟抗体库进行体外转录翻译后,用E2-BSA和E2-磁珠作为抗原固液相交替筛选雌二醇的模拟抗体，通过改变Mg2+浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。然后重复体外转录-体外翻译-亲 和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟抗体DNA文库。经过八轮核糖体展示筛选后，模拟抗体文库中抗原阳性的模拟抗体序列明显富集。3.雌二醇模拟抗体的可溶性功能表达将八轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子，将该基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中，以空质粒宿主菌为对照，E2-BSA为包被原，E2为竞争小分子，竞争ELSIA检测诱导上清的竞争结合活性，有竞争结合活性的进一步大规模诱导表达并纯化。4.雌二醇模拟抗体的纯化与鉴定利用Ant1-His tag亲和层析柱对表达的特异结合物进行了纯化,使目的条带得到了明显的浓缩和分离，竞争ELISA分析纯化后产物的竞争结合活性。SPR法检测所获模拟抗体的亲和力。本发明还可以提供一种测定环境和食品中雌二醇残留的检测试剂盒中的最关键检测试剂——特异结合模拟抗体，尽管E2残留严重威胁着人体健康，但它在畜牧业上的应用仍能带来一定的经济价值，这使得非法使用现象屡禁不止，本发明制备的雌二醇模拟抗体可以部分取代测定食品和环境样品中雌二醇残留测定所需试剂，该模拟抗体还可以进一步应用于临床上血清或尿液中雌二醇的检测。本发明所制备的抗雌二醇模拟抗体的优势在于:(1)利用雌二醇-BSA和雌二醇-磁珠作为抗原固相和液相交替筛�。梢钥朔﨎SA造成的干扰，从而获得E2高特异性的抗体；(2)所获得的ancalin-E2序列清楚，便于基因工程操作，易于在大肠杆菌中可以大量功能表达；(3)分子量�。庖咴匀酰吹慕徊搅俅灿τ玫於嘶�。
图1核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建，A为建库的过程示意图，B为模拟抗体库框架示意图.
图2构建核糖体展示anticalin模拟抗体库的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNAmarker, I为核糖体展示anticalin模拟抗体库DNA图3八轮筛选后每轮RT-PCR产物的产量分析。图4anticalin_E2诱导表达产物的鉴定，其中A图诱导破碎后上清的SDS-PAGE电泳图，B图为相应的Western-blotting图，1-4分别为四种anticalin_E2,M为蛋白Marker。图5 直接 ELISA 分析 anticalin_E2 的结合活性.其中 E2-A、E2-B、E2-C 和 E2-D分别为四种anticalin_E2.
图6间接竞争ELISA分析anticalin_E2的竞争结合活性，四种anticalin_E2检测 E2 的 IC50 分别为 0.05,0.92,2.52,0.41 μ g/ml。图7SPR分析anticalin_E2A的结合动力学常数
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。实施例1核糖体展示anticalin模拟抗体的构建一.引物合成根据bbp 序列及构建Anticalin抗体库需要改变的突变位点来设计合成引物，随机核酸编码区设计成NNK (N为G、C、A、T ;K为G和T)，同时设计与核糖体展示元件相连的引物，主要引物如下表所示。表I寡核苷酸引物
权利要求
1.一种雌二醇模拟抗体的制备方法，主要由以下步骤组成: (1)核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建 选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein, bbp)作为anticalin库的模板,设计随机突变位点，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Anticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库,该库转录后的RNA分子包括一个5’ -loop和3’ -loop莖环结构，一个核糖体结合位点，随机突变的anticalin库，C末端间隔序列等,全长约950bp ； (2)抗雌二醇模拟抗体的筛选 将构建的核糖体展示anticalin模拟抗体库进行体外转录翻译后,用E2-BSA和E2-磁珠作为抗原固液相交替筛选雌二醇的模拟抗体，通过改变Mg2+浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库；然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟抗体DNA文库；经过八轮核糖体展示筛选后，模拟抗体文库中抗原阳性的模拟抗体序列明显富集； (3)雌二醇模拟抗体的可溶性功能表达 将八轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子，将该基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中，以空质粒宿主菌为对照，E2-BSA为包被原，E2为竞争小分子，竞争ELSIA检测诱导上清的竞争结合活性，有竞争结合活性的进一步大规模诱导表达并纯化； (4)雌二醇模拟抗体的纯化与鉴定 利用Ant1-His tag亲和层析柱对表达的特异结合物进行了纯化，使目的条带得到了明显的浓缩和分离，竞争ELISA分析纯化后产物的竞争结合活性；SPR法检测所获模拟抗体的亲和力。
2.权利要求1所述随机突变库的模板可以是其他Iipocalin分子,优选bbp。
3.权利要求1所述筛选方法中的包被原可以选用E2-BSA，还可以选用E2-磁珠进行筛�。叛〗徊嫔秆�。
全文摘要
本发明涉及一种β-雌二醇模拟抗体的筛选方法及其应用，属于生物技术领域，该模拟抗体是由核糖体展示anticalin模拟抗体库中筛选出来的并进行了可溶性功能表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选雌二醇模拟抗体的方法。本发明筛选出的雌二醇模拟抗体可以应用于雌二醇非法添加及滥用检测与研制快速检测雌二醇残留的免疫速测试剂盒。
文档编号G01N33/74GK103172740SQ20111044066
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者宁保安, 刘建青, 彭媛, 孙亚楠, 白家磊, 柳明, 高志贤, 孙思明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所
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