专利名称：检测肺癌蛋白的质谱模型及构建方法
技术领域：
本发明涉及恶性肿瘤检测领域，为一种全新的非入侵性检测方法，在体外对肺癌进行早期的发现和检测。
背景技术：
肺癌在近年来已逐步代替肝癌成为我国恶性肿瘤的首位死亡原因，占全部恶性肿瘤死亡人数的22. 7%，并且肺癌的发病率和死亡率仍在继续上升。根据卫生部全国肿瘤防治办公室提供的资料显示，自2000 2005年间，中国肺癌的发患者数估计增加12万人。其中，男性肺癌患者从2000年的沈万人增加到2005年的33万人，同期女性肺癌患者从12 万人增加到17万人。目前我国肺癌发病率每年增长沈.9%，如不及时采取有效控制措施， 预计到2025年，我国肺癌患者将达到100万，成为“世界第一”肺癌大国。肺癌的早期诊断有利于帮助患者早期进行治疗，早期开展治疗的肺癌预后效果好，不容易复发。肺癌的症状主要有咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困难以及肿瘤引起的阻塞、压迫和肿瘤转移表现的各种症状，其症状有轻有重，早期不易引起人们注意。临床医师对中年以上久咳不愈或出现血痰以及肺部X线检查发现性质未明的块影或炎变的病例提高警惕，高度怀疑肺癌的可能性，及时进行周密检查。我们应用基于质谱的蛋白质组学技术提供一种可用于早期诊断的方法。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比， 检测离子。尽管MALDI-T0F的准确度高达0. 1 % 0. 01 %，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，但在肿瘤标志物尤其是肺癌标志物的应用中仍然存在一些缺陷， 因此国内迄今为止尚无采用MALDI-T0F-MS技术获得检测肺癌标志物或肺癌血清特征蛋白的报道。
发明内容
本发明目的是为了克服已有对肺癌标志物或肺癌血清特征蛋白检测技术的不足之处，提出一种用于检测肺癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。本发明的第一个目的是提供一种用于检测肺癌特征蛋白的质谱标记，该质谱标记是质荷比为 4054m/z、2273m/z、409 lm/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z、5337m/z 的峰。本发明的第二个发明目是提供一种用于检测肺癌特征蛋白的质谱模型，该质谱模型包括质荷比为 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰，模型中表征为 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的蛋白是肺癌血清特征蛋白，其中4054m/z、2273m/z、409lm/z、3955m/z、3192m/z特征蛋白的表达都下调，3884m/z、5337m/z的表达都上调时，预示为肺癌患者或潜在患者。所述的4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z和3192m/z特征蛋白的下调表达的临界值分别为 141. 88士57. 55,37. 13士8. 15,189. 43士61. 91,130. 06士 110. 44 和 78. 65士23. 6。所述的 3884m/z、5337m/z特征蛋白的上调表达的临界值分别为20. 79士5. 78和214.79。其中，所述的表征为质荷比为4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、 3884m/z 和 5337m/z 的多肽的氨基酸序列分别如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示。在一个具体实施方案中，所述的质谱模型的构建方法，包括1)收集多例临床确诊的肺癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本， 进行低温冷冻备用；2)对血清蛋白进行质谱前预处理；3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读�。竦昧阶檠宥嚯牡闹肝仆计祝�4)对所有的肺癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的七个肺癌特征蛋白 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z，对差异多 Jft 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 进行多Jft序列测定，根据这七个质荷比峰建立检测肺癌特征蛋白的质谱模型。其中，所述步骤2、的预处理包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。其中，所述步骤3)采用WCX2芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子 WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读�。竦昧阶檠宥嚯牡闹肝仆计�。本发明结合生物信息学方法筛选出相应的肺癌标志物并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选期望的血清特征蛋白并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理，保留出峰数量大于50的质谱图谱数据，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选。本发明中，变异系数优选为16.2%。本发明检测肺癌特征蛋白的质谱标记，可用于建立血清特征蛋白质谱模型以及应用于在肺癌早期检测和筛查，本发明的质谱模型，可用于肺癌的早期检测和筛查。本发明与其它肺癌的检测方法比较，具有以下优点第一，本发明采用肺癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行对肺癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到肺癌患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗肺癌的药物中。第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供肺癌的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。
第四，利用本发明分析了 148份血清样品，训练组94例，验证组M例，验证结果显示，51例判断正确，检出率达94. 44%,特异性为90%，灵敏性为95. 5%，因此本发明可对肺癌做出早期的诊断，提早对病人治疗，延长生命。
图1为部分健康人血清和肺患者血清的多肽图谱，其中A-C为肺癌患者血清，D-F 为健康人血清。图2重复做样的5个Sigma血清质谱指纹图。图3-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为4054m/z的肺癌特征蛋白峰；图3-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的4054m/z的特征蛋白带。图4-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为2273m/z的肺癌特征蛋白峰；图4-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的2273m/z的特征蛋白带。图5-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为4091m/z的肺癌特征蛋白峰；图5-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的4091m/z的特征蛋白带。图6-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为3955m/z的肺癌特征蛋白峰；图6-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的3955m/z的特征蛋白带。图7-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为3192m/z的肺癌特征蛋白峰；图7-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的3192m/z的特征蛋白带。图8-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为3884m/z的肺癌特征蛋白峰；图8-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的3884m/z的特征蛋白带。图9-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为5337m/z的肺癌特征蛋白峰；图9-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图， 其中箭头指向建模型的5337m/z的特征蛋白带。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1肺癌质谱模型的建立1.样本和仪器选自94例血清样本，其中60例来自肺癌患者，另外34例来自健康人群，肺癌患者均经术后病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽�。掷胙搴蟠⒋嬖�-80低温冰箱中。基质辅助激光解析飞行时间质谱Autoflex II T0F/T0F及实验用的WCX磁珠试剂盒由美国Bruker公司研制。使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处理，处理后的数据采用统计分析软件R2. 6. 2的遗传算法包genalg进行处理。2.技术路线血清的采集收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混勻。室温(25°C )血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2. OOOg 离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0. 5ml离心管，同一血清样品50 μ 1 —管，分装多管。立即冻存血清样品于-80°C。 由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80°C保存多年。血清样品的磁珠处理在进行Clirfrot实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60-90分钟。取出10 μ 1磁珠结合缓冲液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠悬浮液，5μ1血清样品至样品管，混勻。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100 μ 1磁珠清洗缓冲液(WQ，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100 μ 1磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5 μ 1磁珠洗脱缓冲液(EQ，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的刚加入5μ 1磁珠稳定缓冲液 (SS)O. 5ml 样品管。3.生物信息学方法(一 )质谱数据采集应用Autoflex II T0F/T0F质谱仪。激光能量50 %时，IOshots去杂，36 %时 50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率50Hz。数据收集范围l-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于lOOppm。参见图1，图1中为血清多肽指纹谱图，前三个(肺癌A-C)为肺癌患者的，后三个(normal E-F)为健康人的。实验质控(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N > = 5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。 (2)针对整个实验操作，采用Sigma血清的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为16. 2%，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好，参见表1、图2。表1为 Sigma血清中12个蛋白峰的变异系数值；图2为实验中5个SigmaA-E血清的指纹图谱。表1 Sigma血清的组内变异系数
权利要求
1.用于检测肺癌特征蛋白的质谱标记，其包括质荷比为4054m/z、2273m/z、4091m/z、 3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰。
2.根据权利要求1所述的质谱标记，其特征在于，所述的表征质荷比为4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的多肽的氨基酸序列分别如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ IDNo. 7 所示。
3.用于检测肺癌特征蛋白的质谱模型，其特征在于，该质谱模型中包含质荷比为 4054m/z、2273m/z、409 lm/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰，其中，当 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z 的峰都下调表达，以及 3884m/z 和 5337m/z 的峰上调表达时预示为肺癌患者或潜在患者。
4.建立权利要求3所述质谱模型的方法，包括如下步骤1)收集多例临床确诊的肺癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；2)对血清蛋白进行质谱前预处理；3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读�。竦昧阶檠宥嚯牡闹肝仆计祝�4)对所有的肺癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的七个肺癌特征蛋白 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z，对差异多Jft 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 进行多Jft序列测定，根据这七个质荷比峰建立检测肺癌特征蛋白的质谱模型。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤幻预处理的方法包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测肺癌特征蛋白的质谱模型，该质谱模型包括质荷比为4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z和5337m/z的峰，模型中表征为质荷比4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z和5337m/z的蛋白是肺癌血清特征蛋白，当4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z的峰下调表达，以及3884m/z、5337m/z的峰上调表达时预示为肺癌患者或潜在患者。本发明的质谱模型，可用于肺癌早期检测和筛查，方法简单易于操作，准确性高，为肺癌早期检测和筛查提供了新的思路。
文档编号G01N21/64GK102323246SQ20111021698
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者任晶, 胡晓慧, 赵艳梅, 马庆伟 申请人:毅新兴业(北京)科技有限公司
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