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专利名称：一种评价蜂王浆贮存条件适合性的方法
技术领域：
本发明涉及一种食品质量评价方法，具体是涉及一种蜂王浆贮存 条件适合性的评价方法。
背景技术：
蜂王浆(Royal jelly)是由哺育蜂头部咽下腺(Hypopharyngeal gland) 和上颚腺(Mandibulargland)共同分泌的，具有酸、涩、辣、甜且略带 特殊芳香气味的乳白色或淡黄色的浆状物。蜂王浆在蜜蜂的级型分化 中发挥着重要的作用，同样由蜂王产下的受精卵孵化成的小幼虫，如 果在整个幼虫期都被饲喂蜂王浆，只需16d就能发育成生殖器官完全 的蜂王；如果只在幼虫期的前三天饲喂蜂王浆，随后改喂蜂蜜和花粉， 需要21d,并只能发育成生殖器官不完全的工蜂。
蜂王浆的组分非常复杂，富含蛋白质、碳水化合物和脂类，还包 含许多可能发挥重要生理功能的微量组分。蜂王浆含有丰富的生物活 性物质，具有诸如抗疲劳、抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、促生长等多 方面的营养保健作用，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的 应用价值。
由于一些活性成分对贮存温度和lfc存时间敏感，蜂王浆对贮存条 件要求较高。若贮存不当(温度过高或贮存时间过长)，其物理性状、 化学成分及其品质会发生显著变化，致使其保健功效降低甚至丧失。 人工饲养蜜蜂幼虫实验表明，贮存不当的蜂王浆不能使蜜蜂幼虫正常 发育。长期临床验证也表明，蜂王浆所经历的贮存条件是决定蜂王浆 品质的极其关键的因素。但是由于缺少相应的评价方法，质量监管部 门及加工、贸易企业迄今无法在蜂王浆生产和流通过程中进行有效的 监管和控制，难以对蜂王浆所经历的贮存条件和品质做出如实的评
价，从而导致巿场上蜂王浆质量良莠不齐。

发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种可如实反应蜂王浆所经 历贮存条件、评定蜂王浆品质的方法。
美拉德反应是食品中胺基化合物(氨基酸、肽及蛋白质)与羰基 化合物(糖类)在食品加工和储藏过程中自然发生的反应。其反应过 程会使食品中的蛋白质和氨基酸大量损失。蜂王浆富含蛋白质、氨基 酸和碳水化合物(如果糖、葡萄糖等)，贮存过程中发生美拉德反应 几乎是不可避免的。在贮存过程中，蜂王浆中游离氨基酸和组成蛋白 质或多肽的一些氨基酸易参与美拉德等反应或通过氨基酸的脱氨基、 脱羧基反应发生降解，从而引起一些氨基酸含量在贮存过程中发生变 化。
实验发现，蜂王浆中组成蛋白质的氨基酸Met，包括游离Met， 与贮存时间和贮存温度存在线性相关，与蜂王浆的品质也存在线性相 关。因此，本发明提供一种能够如实、准确地评价蜂王浆所经历贮存 条件度、评定蜂王浆品质的方法。
本发明提供一种评价蜂王浆贮存条件适合性的方法，包括以下步
1) 水解蜂王浆；
2) 测定蜂王浆中Met总含量；
2)根据蜂王浆Met总含量来判断蜂王浆所经历的贮存条件。 本发明的评价蜂王浆贮存条件适合性的方法，通过Met总含量的 变化来判断蜂王浆所经历的贮存时间和温度
当Met总含量小于1.89士0.11 mg/g时，相当于蜂王浆在25。C条件 下贮存超过了l个月。在这里，以蜂王浆在25。C条件下贮存超过了1 个月时的Met总含量的上限和下限作为两个阈值，来评价蜂王浆的新 鲜度，即Met总含量小于或等于1.78mg/g的蜂王浆为不新鲜蜂王浆，
相当于蜂王浆在25'C条件下贮存超过1个月；Met总含量大于或等于
2.00 mg/g的蜂王浆为新鲜蜂王浆；Met总含量处于1.78和2.00 mg/g之
间的蜂王浆介于其中，为较不新鲜蜂王浆。
其中的Met总含量是指蜂王浆中游离Met的含量和蛋白质水解过
程中产生的Met含量的总和。
氨基酸含量测定可以釆用氨基酸分析仪或液相色谱仪。
测定总氨基酸含量的样品前处理方法为酸解、碱解或酶解。
根据长期的科学研究和实践经验，蜂王浆不能在高温下长期保
存， 一般认为蜂王浆在25。C保存不能超过1个月，在4'C下保存不能超
的贮存，王浆也就被认为是不新鲜的。因此，我们可以选用蜂王浆在 25'C保存1个月或者在4。C下保存3个月时的Met总含量作为评价蜂王 浆贮存条件适合性和新鲜度的一个阈值。经过多样品测试，发现蜂王 浆在25。C保存l个月时的Met总含量为1.89 ±0.11 mg/g，而在4。C下保 存3个月时的Met总含量为1.85士0.13mg/g。因此，选择蜂王浆在25。C 保存l个月时的Met总含量的上限2.00 mg/g和下限1.78 mg/g作为评价 蜂王浆贮存适合性和新鲜度的两个阈值。
本发明评价蜂王浆贮存条件适合性的方法具有如下优点
1) 能如实反应蜂王浆所经历的贮存条件，温度梯度和时间梯度 均能在总Met含量高低上表现出差异，从而确定蜂王浆的品质，以及 判断是否经历不适当的贮存及贮存条件是否合格等；
2) 灵敏度高，分析方法简单。


图l是26种氨基酸标准样品的UPLC色谱图。 图2是蜂王浆在25。C贮存过程中总氨基酸Met含量变化图。 图3是在不同温度下贮存6个月的蜂王浆总氨基酸色谱图，从上 到下分别为贮存于2 5 °C 、 4 。C和-18 。C的王浆样品。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
将巿购的26种氨基酸标准样品组氨酸(His)，丝氨酸(Ser)，精 氨酸(Arg),甘氨酸(Gly),天门冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu),苏氨 酸(Thr),丙氨酸(Ala),羟基赖氨酸(Hylys),脯氨酸(Pro),半胱 氨酸(Cys)，赖氨酸(Lys)，酪氨酸(Tyr)，蛋氨酸(Met)，缬氨酸(Val)， 异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，苯丙氨酸(Phe),牛磺酸(Tau), Y-氨基丁酸(GABA)，氨基异丁酸(AABA),鸟氨酸(Orn)，谷氨酰胺 (Gln)，天门冬酰胺(Asn),羟基脯氨酸(Hypro)和色氨酸(Trp)Ugma 公司)溶于纯净水中，终浓度为5pmoles/juL (其中Cys为2.5pmoles/ HL)，用超高效液相色谱仪测定，得到标准液相色谱，见图l。
将新采收的茶花蜂王浆(浙江)分为5份，在25。C下贮存，分别 在釆收当天、采收后1个月、3个月、6个月和10个月测定总氨基酸含 量。
准确称取0.5g蜂王浆于Pyrex⑧具盖耐热管中，精确到0.01g。依次 加入3mL超纯水和3mL12MHCl，借助于涡旋振荡器充分混匀。缓慢 冲入氮气将耐热管中空气排出后拧紧管盖，密封，置于烘箱中，在iio 'C保持24h进行水解。水解完成后将加热管从烘箱中取出，冷却至室 温，水解产物经过滤纸过滤后用6MNaOH中和至pH为4.95，用超纯 水定容至50mL，然后取出2.0mL提取液，再次用超纯水定容至10.0mL, 即为分析用样液。用0.22 jd m滤膜(Millipore， MA， USA)过滤后用超高 效液相色谱仪测定。
结果表明，釆收当天、釆收后1个月、3个月、6个月和10个月蜂 王浆总氨基酸Met的含量分别为2.04、 1.89、 1.56、 0.64、 0 mg/g，呈 梯度下降趋势(图3)。说明蜂王浆总Met含量能很好的反应蜂王浆的 贮存时间造成的影响。
实施例2
将新釆收的油菜蜂王浆(河南)分为3份，分别在-18'C、 4'C和 25'C下贮存，分别在贮存期为6个月测定总氨基酸含量。
准确称取0.5g蜂王浆于Pyrex⑧具盖耐热管中，精确到0.01g。依次 加入3mL超纯水和3mL12MHCl，借助于涡旋振荡器充分混勾。缓慢 冲入氮气将耐热管中空气排出后拧紧管盖，密封，置于烘箱中，在IIO t:保持24h进行水解。水解完成后将加热管从烘箱中取出，冷却至室 温，水解产物经过滤纸过滤后用6M NaOH中和至pH为5.01，用超纯 水定容至50mL,然后取出2.0mL提取液，再次用超纯水定容至10.0 mL,即为分析用样液。用0.22jnm滤膜(Millipore,MA,USA)过滤后用 超高效液相色谱仪测定。(图5)。
结果表明，当贮存期为6个月时，贮存于-18。C、 4。C和25。C的蜂王 浆总氨基酸Met的含量分别为2.10、1.77和0.64 mg/g，呈梯度下降趋势， 说明总氨基酸Met含量能很好地反应贮存的温度条件对蜂王浆所造成 的影响。 实施例3
分别釆集新鲜的茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐 蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)样品各50份，共200个样品，在 25°C下贮存l个月。然后准确称取0.5g蜂王浆于Pyrex⑧具盖耐热管中， 精确到0.01g。依次加入3mL超纯水和3mL12MHCl，借助于涡旋振荡 器充分混匀。缓慢冲入氮气将耐热管中空气排出后拧紧管盖，密封， 置于烘箱中，在11(TC保持24 h进行水解。水解完成后将加热管从烘 箱中取出，冷却至室温，水解产物经过滤纸过滤后用6M NaOH中和 至pH为4.96，用超纯水定容至50 mL,然后取出2.0mL提取液，再次 用超纯水定容至10.0mL，即为分析用样液。用0.22jum滤膜(Millipore， MA， USA)过滤后用超高效液相色谱仪测定。
结果表明，在25。C下jfc存l个月时的茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂
王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)的Met总含 量分别为1.87 ± 0.06 mg/g、 1.90 ± 0.12 mg/g、 1.84 ± 0.09 mg/g、 1.88 ±0.13 mg/g,说明在25。C下贮存1个月时，不同来源的蜂王浆的Met 总含量基本保持在1.78 2.00 mg/g之间，保持稳定，平均含量为1.89 ±0.11 mg/g。 实施例4
分别釆集新鲜的茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐 蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)样品5份，在4。C下贮存3个月。 然后准确称取0.5g蜂王浆于Pyrex⑧具盖耐热管中，精确到0.01g。依次 加入3mL超纯水和3mL12MHCl，借助于涡旋振荡器充分混匀。缓慢 冲入氮气将耐热管中空气排出后柠紧管盖，密封，置于烘箱中，在IIO 。C保持24h进行水解。水解完成后将加热管从烘箱中取出，冷却至室 温，水解产物经过滤纸过滤后用6M NaOH中和至pH为4.96，用超纯 水定容至50 mL，然后取出2.0mL提取液，再次用超纯水定容至10.0 mL，即为分析用样液。用0.22jum滤膜(Millipore,MA,USA)过滤后用 超高效液相色谱仪测定。
结果表明，在4'C下贮存3个月时的茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂 王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)的Met总含 量分别为1.82 ± 0.09 mg/g、 1.88 ± 0.14 mg/g、 1.87 ± 0.09 mg/g、 1.83 ±0.11mg/g，说明在4。C下贮存3个月时，不同来源的蜂王浆的Met总 含量基本保持在1.80 1.94 mg/g之间，保持稳定，平均含量为1.84士 0.07 mg/g。 实验例1
分别称取巿售蜂王浆样品A(山东，批号20070815), B(北京， 批号20080409)， C(湖北，批号20070106)和D(浙江，批号20071013) 样品5份，在25C下贮存1个月。然后准确称取0.5g蜂王浆于Pyrex⑧具 盖耐热管中，精确到0.01g。依次加入3mL超纯水和3mL12MHCl，借 助于涡旋振荡器充分混匀。缓慢冲入氮气将耐热管中空气排出后拧紧
管盖，密封，置于烘箱中，在11(TC保持24 h进行水解。水解完成后 将加热管从烘箱中取出，冷却至室温，水解产物经过滤纸过滤后用6M NaOH中和至pH为4.87，用超纯水定容至50mL,然后取出2.0mL提取 液，再次用超纯水定容至10.0mL，即为分析用样液。用0,22jum滤膜 (Millipore, MA, USA)过滤后用超高效液相色谱仪测定。
结果表明，巿售的四种蜂王浆样品Met总含量分别为A, 2.07 mg/g; B, 2.19mg/g; C， 1.86mg/g; D, 1.69mg/g;从而判断A和B 品质等级为新鲜，C和D品质等级为不新鲜。其中，样品D的生产批号 为20071013，但仍不新鲜的原因在于企业生产加工前蜂王浆可能已经 在不适条件下贮存了 一段时间。试验结果与感官检验的结果是 一致 的。
权利要求
1、一种评价蜂王浆贮存条件适合性的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)水解蜂王浆； 2)测定蜂王浆中Met的总含量； 3)根据蜂王浆Met的总含量来判断蜂王浆所经历的贮存条件。
2、 如权利要求l所述的评价蜂王浆贮存条件适合性的方法，其特 征在于，通过Met的总含量来判断蜂王浆所经历的贮存条件Met总含量小于或等于1.78mg/g的蜂王浆为不新鲜蜂王浆，相当 于蜂王浆在25。C条件下贮存超过1个月；Met总含量大于或等于2.00 mg/g的蜂王浆为新鲜蜂王浆；Met总含量处于1.78和2.00 mg/g之间的 蜂王浆介于其中，为较不新鲜蜂王浆。
3、 如权利要求1或2所述的评价蜂王浆贮存条件适合性的方法， 其特征在于，Met总含量是指蜂王浆中游离Met的含量和蛋白质水解 过程中产生的Met含量的总和。
4、 如权利要求1或2所述的评价蜂王浆贮存条件适合性的方法， 其特征在于，氨基酸含量测定采用氨基酸分析仪或液相色谱仪。
5、 如权利要求l所述的评价蜂王浆贮存条件适合性的方法，其特 征在于，测定总氨基酸含量的样品前处理方法为酸解、碱解或酶解。
全文摘要
本发明提供一种蜂王浆贮存条件适合性的评价方法。该方法通过测定蜂王浆中Met的总含量；然后根据蜂王浆Met的总含量来判断蜂王浆所经历的贮存条件的适合性，进而评判蜂王浆的品质优劣。本发明能灵敏地判定蜂王浆所经历的贮存条件，为生产厂家和消费者准确判断蜂王浆的品质提供依据，也可完善现行蜂王浆质量标准，有效监控蜂王浆质量。
文档编号G01N1/28GK101363829SQ20081022338
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者吴黎明, 周金慧, 熠 李, 胡福良, 薛晓锋, 静 赵 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所