专利名称：一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法
技术领域：
本发明涉及一种烤烟醇化品质的分析判定方法，尤其是一种烤烟醇化品质 判定的高效液相指纹图谱分析方法。
背景技术：
烟叶醇化是巻烟生产的重要环节，同时也是烟叶吸食品质改善的一个重要步骤，在提高巻烟成品质量和加强成本控制方面发挥着十分重要的作用。在醇化过程中，烤烟片烟内部发生一系列复杂的生理生化及纯化学的变化，导致内部化学成分的改变，进而引起烟叶品质的改善。烟叶中的化学成分是决定烟叶品质的内在因素，烟叶的化学成分主要包括羰基化合物、氨基酸、蛋白质及其含氮化合物、生物碱和其他含氮杂环化合物、 酶、有机酸、酚类化合物、色素、石油醚提取物、矿物质等；经进一步研究表明，烟叶的化学成分变化主要有两个特征， 一是不具有香气特征的大分子化合 物如总糖、还原糖、淀粉、总氮、蛋白质、氨基酸、烟碱、类胡萝卜素和高级脂肪酸等发生降解和转化，含量呈下降趋势；二是芳香性的小分子化合物如总 有机酸、羰基化合物如醇、醛、酮类、烟叶精油以及糖苷态香气物质得到合成、 转化和积累。在烟叶醇化过程中，烟叶挥发性酸、挥发性羰基化合物含量以及 烟叶精油中绝大多数香气成分含量显著增加，并符合二次曲线变化规律；醇化 过程中烤烟片烟中的还原糖、烟碱、挥发碱、淀粉含量及pH值均随着醇化时 间的延长呈持续降低趋势，挥发酸含量则逐渐增加，总氮含量无明显变化。依据烟叶醇化过程中化学成分变化的基本特征，探讨以化学分析与感官评 吸相结合的醇化质量评价方式，对于减少和克服传统评价方式的缺陷，增加客 观性和评价的准确性具有积极的意义。多年来，烟草科研人员试图用简单有效 的化学方法来代替传统的感官质量评吸方法。但是，由于影响烟叶抽吸品质的 因素是各化学成分的复杂平衡关系导致，所以利用化学指标方法来判断烟叶的醇化质量显得单一、片面；然而，目前还没有广泛适用的化学分析和仪器分析 方法，这就限制了在生产上的应用。我们在研究中发现指纹图谱技术是对�：� 物质研究的最佳方法，通过指纹图谱技术判断烟叶的醇化质量具有全面性和均一性。指纹图谱的概念是从中药药材的药性研究中首先提出来的，其定义是指样 品经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该样品特性的共有峰 的图谱。当前，色谱技术的多样化和检测能力的增强为指纹图谱研究和应用提 供了良好的工作平台，针对此项技术，所涉及的方法种类繁多，包括TLC、TLCS、 HPLC、 HPLC/MS、 GC、 GC/MS、 HPCE、 IR、 NMR及X射线衍射等。其中 色谱技术是主流，尤其是TLCS、 HPLC和GC己是大家所公认的三种常规的 分析手段。随着科学技术的发展，色谱分析仪器的完善与提高，在克服自身固 有缺陷，发挥自身优势方面有了长足发展，成为三种互相补充、相互结合的分 析手段。其中HPLC方法随新的高效通用型检测器的发展，使得HPLC的适用 性和灵敏度得到显著提高，从而使复杂样品的成功分析成为可能。烟叶的指纹图谱是利用色谱技术获得的烟叶特征提取物的色谱图，这是一 种综合的、可定性化的鉴别方法，借助MS， NMR法对烟叶的特征提取物进行 定性，通过内标和外标进行定量的先进方法。本发明对烤烟片烟在醇化过程中 指纹图谱变化规律研究的基础上，建立了不同条件下烟叶醇化品质与指纹图谱特征之间的关系，筛选出适宜的烟叶醇化品质的指纹图谱判定方法，为指导烟 叶醇化过程和准确判断醇化质量提供技术支撑。研究对于减少和克服传统评价 方式的缺陷，增加客观性和评价的准确性具有积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方 法，该方法测定的结果与感官评吸结果具有很好的一致性，有利于增强判定烟 叶醇化品质的客观性。
为实现本发明目的所采取的技术方案是它是采用高效液相色谱分析方法 测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件 对特征峰进行分析，建立特征峰与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官 质量为依变量y，指纹图谱总面积X为因变量，建立两者的回归关系模型为Y =72.04974+0.1388*LN(X)*LN(X);根据所测样品的指纹图谱总面积X，计算出 感官质量Y。
其中进行高效液相色谱分析时，流动相A: 0.1%的甲酸；B:乙腈，进样 量10ul;流量5.0ml/vmin;柱温25°C ，采用剃度洗脱在0~40min乙腈由O.OV/V 至lj50， 40~45min由50变为100，然后保留5min，在50—55min变为0，保留 5min。
本发明的另一种技术方案是以感官质量为依变量y，指纹图谱总面积x为 因变量，建立两者的另一回归关系模型为Y=X/(0.011081*X+13.247);根据所 测样品的指纹图谱总面积X，计算出感官质量Y。从而对烤烟的醇化品质做出判定。
本发明利用HPLC分析技术，建立烤烟指纹图谱特征峰与感官质量之间的相关关系，进而建立指纹图谱特征峰与感官质量的多元回归模型，利用多元回 归模型对烟叶的感官质量进行检测。它的有益效果是提供了一种客观的烤烟醇 化品质的判定方法，且准确性和可靠性高；提出的指纹图谱方法和感官评吸方 法评价烟叶醇化质量具有一样的效果；该方法简单实用，操作简便，非常适合 作为烤烟质量的检测方法。
图1为烟叶指纹图谱特征峰示意图
具体实施例方式
通过具体的实施例子对本发明进一步说明。
指纹图谱的优势主要是能够反应具有复杂成分的植物材料及其制剂内在质 量的均一性和稳定性。烟叶质量因产区的生态环境、等级、部位及醇化时间的 不同而有明显差异，而指纹图谱既具有判断该对象真伪的"共性",又能反映影响 因素带来的差异性特征,具有物种的唯一性和个体的相似性，从而能够从整体上 反应烟叶的质量。
我们过去曾提出采用碘值法判断烟叶醇化进程，但该方法离生产实际应用 的需要还相差甚远，这些研究仅仅提供了应用非感官方法判断烟草醇化进程和 品质的可行性认识。在烟草醇化的理论与实践研究中，我们在过去指纹图谱理 论与实践研究的基础上，进一步探讨烤烟指纹图谱特征值与醇化进程和醇化品 质的关系，并建立了综合预测模型。同时，本项目重点研究了所提出判断方法 的影响因子及指标体系，明确其应用条件和范围，使该方法的应用更具有广泛 的适用性和实际可操作性。
实施例为推广本发明的指纹图谱方法，特将本发明的方法应用与不同醇化时间、不同产地的烤烟进行了醇化质量判定实验。采用的样品见表l:
表l:试验验证采用的样品一览表
6大，份 2005年福建C3F 2005年云南C3F 2005年四川C3F 2005年贵州CFL 2005年湖北C3L 2005年东北CFL
4个生态地区 """2005年湖北BLF~~ 2005年湖北XFL 2005年云南BFL 2005年云南XFL 2005年贵州BFL 2005年贵州BFL 2005年四川BFL-B3L 2005年四川BFL-CX1K
2个年份 2005年云南C3F-B
2005年四川C2L 2005年湖北C2L-A 2005年东北C2L-A 2004年云南C3F-B 2004年四川C2L 2004年湖北C2L-A 2004年东北C2L-B
从打叶复烤线上取若干供试片烟，按照正常程序装箱打包，然后运回武汉， 存放在指定的试验仓库中。以放置时间为起始醇化时间，每3个月取一次样，
每次取2公斤； 一份切丝巻烟，用于感官评吸；另一份磨粉，用于化学成分及
酶的测定； 一份留样。试验中经过了6此取样，时间分别分别是2006年7月、 2006年10月、2007年1月、2007年4月、2007年7月和2007年10月。整个 过程中，共取样品132个。样品用烘箱在6(TC下烘干，然后用植物粉碎机粉碎， 过60目筛，用塑料袋密封，置于冰箱中保存待测。
样品的感官质量是由湖北中烟工业有限责任公司技术中心技术组评吸委员 会评定。指纹图谱分析是采用Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器，色 谱柱为YMCC8柱，尺寸150*4.6mm，粒径5(im，孔径12nm。取样品液， 在Agilent 1100高效液相色谱仪用DAD检测器进行3D扫描，通过对谱图研究， 选择吸收波长为250nm;用VWD检测器在250nm处对样品进行检测。流动相 A: 0.1%的甲酸；B:乙腈。进样量10ul;流量5.0ml/vmin;柱温25。C;采用剃 度洗脱在0~40min乙腈由0.0 (V/V)到50， 40~45min由50变为100，然后保留5min，在50—55min变为0，保留5min。在上述仪器条件下，得出烤烟 指纹图谱特征峰见图1。
用中草药指纹图谱软件对烟叶的指纹图谱进行分析，结果表明所作烟叶 特征图谱具有高度的稳定性，重现性。
表2:不同批次样品指纹图谱的相似度分析
图谱编号SlS2S3S4S5
S20.9961
S30.9860.9911
S40駕0.9910.9971
S50.9840.990.9990.997I
S60.9830.990.9950.9950.997
通过相似度计算可知，各个特征图谱具有较高的相似度，但同时又能表现 出醇化时间不同所带来的差异性。通过比较不同醇化时间烤烟指纹图谱的相似
度来看，醇化21个月(S6)和醇化6(S1)个月的图谱具有显著差异。说明指纹 图谱一方面可以反映所选用的方法具有重现性，另一方面也可以反应各指纹图 谱的差异性。
为了建立指纹图谱特征峰总面积与感官质量之间的关系，以感官质量为依 变量(y),指纹图谱总面积(x)为因变量，我们经过研究选择如表3的预选回 归模型进行筛�。⒔⒘秸叩幕毓楣叵的Ｐ汀�
表3指纹图谱特征峰与感官评吸的候选回归模型
编号方程
1y = a + bx
2y = a + b/x
31/y = a + b/x
4y = a + b*log(x)5log(y) = a + bx
6log(y) = a + b*log(x)
7log(y) = log(d) + b"og(x)
8ln(y) = ln(d) + bx
9ln(y) = ln(d) + b/x
10y = a + b*xA2
11y = a + b*sqr(x)
12sqr(y) = a + b*sqr(x)
经过筛�。詈笱∪〉闹肝仆计�18个特征峰总面积(X)最优回归模型为:
模型1: Yl = 72.04974+0.1388*LN(X)*LN(X)，
F=8.48，尸<0.0046 ，对应候选模型4。 模型2: Y2=X/(0.011081*X+13.247)，
F=7.86， PO.0064 ，对应候选模型2。 应用上述2个最优回归模型对醇化样品的感官评吸值预测，见表4。由表4 可以看出，模型1对感官质量的预测值误差范围在0-3.0%之间，误差平均值为 1.12%，误差均小于3%;模型2对感官评吸的预测值误差范围在0-4.0%之间， 误差平均值为1.12%，误差均小于4。^。
表4:应用指纹图谱简单模型对醇化样品感官评吸值的预测效果
样品醇化时间感官评吸 值模型l误差 %模型2误差％
6个月84.887.0-2.5387.0-2.54
9个月85.687.0-1.6787.0-1.68
2005年东北CFL12个月86.487.3-1.0187.3-1.03
15个月86.487.1-0.8387.1-0.85
18个月86.487.1-0.7987.1-0.80
21个月86.686.9-0.3886.9-0.38
2005年福建C3F6个月86.187.5-1.5887.5-1.592005年贵州CFL
2005年湖北C3L
2005年四川C3F
2005年云南C3F
05年东北C2L-A
9个月86.287.6-1.5987.6-1.59
12个月86.687.5-1.0587.5-1.06
15个月87.187.3-0.2787.3-0.29
18个月87.487.10.3487.10.33
21个月87.887.20.6487.30.62
6个月85.387.8-2.9087.7-2.86
9个月86.487.9-1.7087.8-1.64
12个月86.787.9-1.3187.8-1.25
15个月86.887.7-1.0987.7-1.06
18个月86.987.9-1.0787.8-1.02
21个月87.187.6-0.5587.6-0.54
6个月85.787.8-2.4587.7-2.41
9个月87.087.9-1.0787.8-1.01
12个月87.888.0-0.2488.0-0.14
15个月88.487.80.6087.80.65
18个月89.387.91.6387.81.68
21个月89.387.71.8387.71.85
6个月86.788.1-1.6488.0-1.52
9个月87.688.0-0.5487.9-0.45
12个月88.187.90.2487.80.30
15个月88.087.80.2587.80.29
18个月88.487.90.5687.80.61
21个月88.587.60.9387.60.94
6个月88.587.80.8087.80.84
9个月88.987.91.0787.91.14
12个月89.088.20.9888.01.11
15个月89.188.11.1388.01.24
18个月89.288.01.2687.91.36
21个月89.087.81.3887.71.41
6个月84.687.2-3.0887.2-3.11
9个月85.187.1-2.2587.1-2.27
12个月85.587.1-1.9687.2-1,9815个月85.687.1-1.6587.1-1.66
18个月86.086.9-1.0486.9-1.04
21个月86.686.30.3786.10.55
6个月85.487.1-1.9987.1-2.01
9个月86.387.1-0.8387.1-0.85
2004年东北12个月86.087.1-1.2687.1-1.28
C2L-B15个月85.687.2-1.8487.2-1.86
18个月88.486.91.7086.91.69
21个月87.386.41.0286.31.15
6个月86.287.8-1.9387.8-1.88
9个月87.287.8-0.7087.8-0.66
2005年湖北12个月87.387.8-0.5287.8-0.48
C2L-A15个月87.587.9-0.5287.9-0.45
18个月87.887.60.2587.60.25
21个月87.387.30.0187.3-0.01
6个月87.988.0-0.0687.90.02
9个月86.687.5-1.0287.5-1.03
2004年湖北12个月89.287.71.6787.71.69
C2L-A-115个月88.787.71.1387.71.16
18个月88.587.61.0487.61,05
21个月88.487.21.3687.21.34
6个月87.187.4-0.3687.4-0.38
9个月87.887.30.5387.30.51
2005年四川C2L12个月88.487.51.0487.51.03
15个月88.487.60.9187.60.92
18个月89.587.22.5587.22.53
21个月88.986.92.2186.92.20
6个月88.987.71.3187.71.34
9个月89.987.62.5687.62.57
2004年四川C2L12个月89.687.52.3687.52.36
15个月89.787.62.4187.62.41
18个月90.187.52.9487.52.93
21个月89.586.53.3986.43.49
2005年云南6个月87.587.6-0.1187.6-0.11
12C3F-B9个月87.887.50.3587.50.34
12个月88.287.70.6687.60.68
15个月87.787.50.2587.50.24
18个月88.087.80.2587.80.28
21个月87.786.80.9886.80.99
6个月87.588.0-0.6288.0-0.52
9个月87.587.8-0.3287.7-0.29
2004年云南12个月87.888.0-0.2587.9-0.17
C3F-B15个月87.887.9-0.1387.9-0.07
18个月88.487.70.7687.70.79
21个月87.987.00.9887.10.97
综上所述，本发明利用烟叶指纹图谱方法判定醇化质量的方法是指纹图谱 特征峰总面积最优回归分析方法，它又分为两种不同的判定模型。两者判定结 果和效果是基本一致的，均具有较高的准确率。这种方法在烟叶的醇化过程中 是首次提出，并首次来加以利用。烟叶醇化过程中的指纹图谱主要是为了表现 和控制烟叶化学成分群的整体，所以指纹图谱能够有较好的重现性。由于烟叶 是一种复杂的体系，包含了一定的不确定度和�：裕匝桃兜闹肝仆计滓� 能够大量的表达烟叶的共性。通过利用烟叶指纹图谱方法判定上述烟叶醇化质 量的效果可以看出，该方法具有准确性高、稳定性好的特点，实际操作中可节 省大量的人力物力财力，使用方便，完全代替利用传统的感官评吸方法对烟叶 醇化质量的判定。
1权利要求
1、一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，它是采用高效液相色谱分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立特征峰与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官质量为依变量y，指纹图谱总面积x为因变量，建立两者的回归关系模型为Y＝72.04974+0.1388*LN(X)*LN(X)；根据所测样品的指纹图谱总面积X，计算出感官质量Y。
2、 根据权利要求1所述的一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，其中进行高效液相色谱分析时，流动相A: 0.1%的甲酸；B:乙腈，进样量10ul;流量5.0ml/vmin;柱温25。C。
3、 根据权利要求1或2所述的一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，其中进行高效液相色谱分析时，采用剃度洗脱在O一Omin乙腈由O.OV/V到50， 40—45min由50变为100，然后保留5min，在50—55min变为0，保留5min。
4、 一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，它是采用高效液相色谱分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立特征峰与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官质量为依变量y，指纹图谱总面积x为因变量，建立两者的回归关系模型为Y=X/(0.011081*X+13.247);根据所测样品的指纹图谱总面积X，计算出感官质量Y。
5、 根据权利要求4所述的一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，其中进行高效液相色谱分析时，流动相A: 0.1%的甲酸；B:乙腈，进
6、根据权利要求4或5所述的一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法，其中进行高效液相色谱分析时，采用剃度洗脱在0"40min乙腈由O.OV/V到50， 40~45min由50变为100，然后保留5min，在50—55min变为0，保留5min。
全文摘要
本发明涉及一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法。它是采用高效液相色谱分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立指纹图谱特征峰总面积与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官质量为依变量y，指纹图谱总面积x为因变量，建立两者的回归关系模型为Y＝72.04974+0.1388*LN(X)*LN(X)或Y＝X/(0.011081*X+13.247)；根据所测样品的指纹图谱总面积X，计算出感官质量Y。本发明具有准确性高、稳定性好的特点，实际操作中可节省大量的人力物力财力，使用方便，完全能够代替利用传统的感官评吸方法对烟叶醇化质量的判定。
文档编号G01N30/00GK101661023SQ20081019680
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者何结望, 辉 司, 吴风光, 孙敬国, 涂书新, 闫铁军 申请人:湖北中烟工业有限责任公司
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