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专利名称：一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法
技术领域：
本发明涉及ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，属于免疫检测领域。
背景技术：
免疫层析试纸条检测也称为免疫侧向层祈，是ー种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉，并可进行现场检测的方法。具有放射性免疫、酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等仪器检测方法所不具备的优点，在检测技术中处于重要地位，是对传统和大型仪器检测方法的有力补充。随着社会的发展，人类对生活质量有了更高的要求，免疫层析检测技术在面对人类疾病、环境污染物、食品安全、动物医学等重大问题时具有重要的作用。当前免疫层析产品主要是基于胶体金技术而开发的，在医学检验、毒品检测、食品安全检测等领域得到了广泛的应用。但该技术由于存在颗粒粒径均一性差、免疫标记物不稳定、顔色単一只能单指标检测、无法实现准确定量检测、灵敏度不高等不足，无法满足人们的需求。因此发明高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉的免疫层析检测方法十分必要。量子点是ー种在光源激发下发射出明亮荧光的半导体纳米晶粒。具有以下特点1、粒径不同，发光颜色不同，并且可以用单一光源激发多种不同顔色的量子点；2、量子点的发射谱狭窄对称，同时激发的多种量子点不易出现重叠，使多重分子同时检测容易实现；3、量子点的量子产率高、荧光强，可以接受长时间反复激发，光化学稳定性好，不易猝灭。

由于量子点具有以上优良特性，使其可能成为分子检测和医学诊断的有力工具，经过近20多年的发展,逐步从细胞、组织标记成像、细胞示踪、活体成像等应用研究开始向临床检测、疾病控制、食品安全检测等领域方向发展。但目前各种现有的涉及量子点的免疫层析试纸条检测方法，或者由于选用的为核型量子点、水相合成的量子点或者量子点包裹微球等，或者由于采取固化方法将其固定在结合区，而影响了检测灵敏度的提高并造成精密度差。

发明内容
为克服现有技术中的不足，本发明提供了ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，该方法是ー种高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉、应用广泛的量子点荧光免疫层析试纸条快速检测方法。实现上述目的的技术方案为ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，具体采用如下步骤(I).量子点标记蛋白液的制备取浓度为11^-101^的0.2-21111101羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mlT200mM、pH6. (T7. 4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照I U mo广5 u mo I EDC/2nmol量子点的比例加入EDC,EDC即碳ニ亚胺盐酸盐,润旋振荡混勻，再按InmoflOOnmol蛋白/Inmol量子点的比例加入浓度为f 10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1-4小时；反应结束后用截留分子量为IOkDa-1OOkDa的离心超滤管超滤浓缩至20-100 y L，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为0. 2-2 u mol/L,保存于lOmM-lOOmM、pH为7. 4^9. 0的、含有质量百分比浓度为0. 05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中，2 8°C冰箱保存备用；(2).量子点标记蛋白检测液的制备将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS-TBN稀释100-1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS-TBN为含20mM-150mM氯化钠NaCUO. 02%-0. 1% 吐温Tween-20、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠 NaN3的IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2 8°C冰箱保存备用；(3).制备包被有检测指标的反应膜检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1 5mg/mL,并将ニ抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1 5mg/mL,按照0. 8 1. 2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及ニ抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3 7mm，放置25 37°C烘箱处理1_3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM-150mM氯化钠NaCl、0. 05%_3%聚こニ醇PEG20000、0. 2%-1% 海藻糖、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠 NaN3 的 IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB ；(4).在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得量子点荧光免疫层析试纸条;(5).定性或定量检测取300uL-500iiL量子点标记蛋白检测液与IOiiL-50 u L待检测样本充分混匀后，取60 u L-100 u L混合液加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-15min即可读取结果； (5.1)定性检测或半定量检测采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域，通过肉眼观察条带发光情况，如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法，当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性；不出现荧光信号则为阴性；如果检测体系为检测小分子物质的竞争法，则结果相反，出现荧光信号的检测线报告为阴性，未出现荧光信号报告为阳性；无论采取哪种方法，如果控制线没有荧光信号则检测结果无效；(5. 2)定量检测配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。由上述技术方案可知，本发明所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法与放射性免疫、酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等方法相比，具有操作安全(无放射污染源)、简便(步骤少，操作简单)和快速(3-15min即可出結果)等优点；与胶体金免疫层析法试纸条相比，本发明标记稳定性好(生物分子与量子点共价结合)、多指标同时检测(不同粒径量子点其荧光发射波长不同，可实现多指标同时检测)、灵敏度高(量子点的荧光强度高，可实现对低丰度靶分子的检测)、定性定量皆可等优点。
本发明所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法，具体可以用双抗体或抗原夹心法(待检分子为大分子物质，免疫结合位点多)、免疫竞争法(待检分子为小分子，免疫结合位点少)等检测分析方法，应用领域广，可用于单项指标或者多指标的高灵敏快速检测，能够检测全血、血清、血浆、唾液、尿液、食品等样本；能用于人类疾病诊断、病原微生物检出、环境污染物检测、毒品检测、食品有毒残留物检测等领域。


图1为实施例1、2的量子点突光免疫层析检测示意图。图2为实施例3的量子点荧光免疫层析多组分检测示意图。图中1、样品垫，2、背村，3、检测区，3-1、检测区A，3-2、检测区B，4、控制区，5、反应膜，6、吸水垫，7、量子点标记蛋白与样品混合物。
具体实施例方式实施例1 :诊断超敏C-反应蛋白量子点标记蛋白检测液的制备采用的羧基水溶性量子点为羧基水溶性核壳型量子点，量子点的发射波长范围是500nm-630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的荧光，其荧光量子产率不低于 45%。取浓度为8 ii M的羧基水溶性量子点250 u L (2nmol)平衡至室温，并用超声波200W处理10秒，按照3 u mo I EDC/2nmol量子点的比例加入IOmg/mL EDC (碳ニ亚胺盐酸盐)57. 5 UL,涡旋振荡混匀，再按照40nmol抗人C-反应蛋白单克隆抗体/2nmol量子点的比例加入10mg/mL抗体0. 6mL,润旋混勻。量子点、EDC、蛋白等均用20mT200mM pH6. 0 7. 4磷酸盐溶液溶解，并在上述溶液体系中加入1.1mL磷酸盐溶液。室温搅拌反应1-4小吋。反应结束后用截留分子量为50kDa的离心超滤管超滤除去没有反应的杂质并浓缩至20 u L,通过装填有Superdex G200填料的凝胶分离柱进行纯化,收集有荧光的组分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为Iu mol/L。然后用PBS-TBN (磷酸盐缓冲液PB、含氯化钠NaCl、吐温Tween-20、牛血清白蛋白BSA、叠氮化钠NaN3)稀释100-1000倍，于疒8°C冰箱保存备用。免疫层析试纸条的组装如图1所示，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜5固定粘贴在PVC背衬2的中间部位，将与标记抗体中所用的抗体非同一表位的抗人C-反应蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体分别用包被缓冲调节浓度至lmg/mL和0. 2mg/mL,,用划膜仪包被到反应膜5上对应的检测区3和控制区4，控制膜液量为1. Oy L/cm，检测区3和控制区4之间间隔为5mm，放置25 37°C烘箱处理2小吋。在上述PVC背衬上按照顺序互相搭接粘贴样品垫I (可为玻璃纤维垫)、反应膜(已粘贴)以及吸水垫6 (可为普通吸水纸)，得到试纸板，按照要求切割成3_宽的试纸条,将试纸条装载于试纸卡内。取400 ii L量子点标记蛋白检测液与30 ii L待检测样本充分混勻成量子点标记蛋白与样品混合物7，取75 ii L混合物7加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-10min即可读取结果。经过系列调试，超敏C-反应蛋白检测限最低可达0. lmg/L。本实施例中量子点荧光免疫层析试纸条所用的量子点为羧基水溶性核壳型CdSe/ZnS量子点，其最大发射波长为605nm，在光源激发下发出明亮的橙红色荧光。
本实施例采用的双抗体夹心法可以用于超敏C-反应蛋白诊断，还适用于こ型肝炎表面抗原(HBSAg)、排卵(LH、促黄体生成素)、心肌肌钙蛋白(Tn-1，Tn_T)、肿瘤标志物(AFP、CEA、CA199、PSA、FOB)等采用双抗体(单克隆抗体-单克隆抗体或者单克隆抗体_多克隆抗体)夹心法模式的免疫层析检测。实施例2 :检测黄曲霉毒素Ml量子点标记蛋白检测液的制备取浓度为8 ii M的羧基水溶性量子点250 ii L(2nmol)平衡至室温，并用超声波200W处理10秒，按照3iimol EDC/2nmol量子点的比例加A 10mg/mL EDC (碳ニ亚胺盐酸盐)57. 5 y L,润旋振荡混勻，再按照40nmol抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体/2nmol量子点的比例加入10mg/mL抗体0. 6mL,涡旋混匀。量子点、EDC、蛋白等均用20mT200mM pH6. 0 7. 4磷酸盐溶液溶解，并在上述溶液体系中加入1.1mL磷酸盐溶液。室温搅拌反应1-4小吋。反应结束后用截留分子量为50kDa的离心超滤管超滤除去没有反应的杂质并浓缩至20 V- L,通过装填有Superdex G200填料的凝胶分离柱进行纯化，收集有荧光的组分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为Iu mol/L，用PBS-TBN (磷酸盐缓冲液PB、含氯化钠NaCl、吐温Tween-20、牛血清白蛋白BSA、叠氮化钠NaN3)稀释100-1000倍，于疒8°C冰箱保存备用。

免疫层析试纸条的组装如图1所示，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，分别将BSA-黄曲霉毒素Ml复合物和羊抗鼠IgG抗体分别用包被缓冲调节浓度至0. lmg/mL和0. 2mg/mL，用划膜仪包被到反应膜上对应的检测区和控制区，控制膜液量为1. Oy L/cm，检测区和控制区之间间隔为5mm，放置25 37°C烘箱处理2小吋。在上述PVC背衬上按照顺序互相搭接粘贴样品垫、反应膜(已粘贴)以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成3mm宽的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内。取300 ii L量子点标记蛋白检测液与40 ii L待检测样本充分混勻成量子点标记蛋白与样品混合物7，取75 ii L混合物7加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-10min即可读取结果。经过系列调试，黄曲霉毒素Ml的检测限最低可达0.2ng/mL。所述量子点荧光免疫层析试纸条所用的量子点为羧基水溶性核壳型CdSe/ZnS量子点，其最大发射波长为605nm，在光源激发下发出明亮的橙红色荧光。本实施例采用的双抗体夹心法可以用于食品安全残留物检测中的黄曲霉毒素Ml的检测，还适用于黄曲霉毒素B1、克伦特罗、吗啡等采用免疫竞争法(单克隆抗体-抗原)模式的免疫层析检测。实施例3 :实现手足ロ病相关柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型的联合检测量子点标记蛋白检测液的制备參考实施例1，分别用发射波长为525nm和605nm的緑色和橙红色量子点标记柯萨奇病毒A16 (CA16)单克隆抗体和肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体，用发射波长为565nm的黄色量子点标记鼠IgG,纯化后浓缩至将三种标记蛋白同等浓度混合，纯化后用PBS-TBN稀释100-1000倍，于2 8°C冰箱保存备用。免疫层析试纸条的组装如图2所示，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，分别将抗体和羊抗鼠IgG抗体分别用包被缓冲调节浓度至lmg/mL和0. 2mg/mL,用划膜仪将柯萨奇病毒A16 (CA16)单克隆抗体和肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体包被到反应膜上对应的检测区A3-1和检测区B3-2，将羊抗鼠IgG抗体包被到控制区，控制膜液量为LOiiL/cm，检测区和控制区之间间隔为4mm，放置25 37°C烘箱处理2小时。在上述PVC背衬上按照顺序互相搭接粘贴样品垫、反应膜(已粘贴)以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成4mm宽的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内。经过系列调试，柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型的检测限最低可达0. 2ng/mL。所述量子点荧光免疫层析试纸条所用的量子点为羧基水溶性核壳型CdSe/ZnS量子点，检测区对应的量子点的最大发射波长分别为525nm为605nm，在光源激发下发出明亮的緑色和橙红色荧光；控制区对应的量子点的最大发射波长为565nm，在光源激发下发出明亮的黄绿色荧光。本实施例采用的双抗体夹心法可以用于同时诊断柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型抗原，还适用于HIV-HBSAg、HBSAg-HCV等采用双抗体(单克隆抗体_单克隆抗体或者单克隆抗体-多克隆抗体)夹心法模式的免疫层析检测。
权利要求
1.一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是至少采用如下步骤 (1).量子点标记蛋白液的制备取浓度为Iμ M-1O μ M的O. 2-2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mlT200mM、ρΗ6. (Γ7· 4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照I μ mo广5 μ mo I EDC/2nmol量子点的比例加入EDC, EDC即碳二亚胺盐酸盐,润旋振荡混勻，再按InmoflOOnmol蛋白/Inmol量子点的比例加入浓度为f 10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1_4小时；反应结束后用截留分子量为IOkDa-1OOkDa的离心超滤管超滤浓缩至20-100 μ L，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为O. 2-2 μ mol/L,保存于lOmM-lOOmM、pH为7. 4 9. O的、含有质量百分比浓度为O. 05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中，2 8°C冰箱保存备用； (2).量子点标记蛋白检测液的制备将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS-TBN稀释100-1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS-TBN为含20mM_150mM氯化钠NaCl、0. 02%-0· 1% 吐温Tween-20、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠NaN3的IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2 8°C冰箱保存备用； (3).制备包被有检测指标的反应膜检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1 5mg/mL,并将二抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1 5mg/mL,按照0. 8 1. 2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及二抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3 7mm，放置25 37°C烘箱处理1_3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM-150mM氯化钠NaCl、0. 05%_3%聚乙二醇PEG20000、0.2%-1% 海藻糖、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠 NaN3 的 IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB ； (4).在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得量子点荧光免疫层析试纸条； (5).定性或定量检测取300uL-500l·!L量子点标记蛋白检测液与10 μ L -50 μ L待检测样本充分混匀后，取60 μ L-100 μ L混合液加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-15min即可读取结果； (5.1)定性检测或半定量检测采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域，通过肉眼观察条带发光情况，如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法，当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性；不出现荧光信号则为阴性；如果检测体系为检测小分子物质的竞争法，则结果相反，出现荧光信号的检测线报告为阴性，未出现荧光信号报告为阳性；无论采取哪种方法，如果控制线没有荧光信号则检测结果无效； (5. 2)定量检测配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。
2.根据权利要求1所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是所述量子点为羧基水溶性核壳型量子点，量子点的发射波长范围是500nm-630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的突光，其突光量子产率不低于45%。
3.根据权利要求1所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是所述检测指标为抗原，则检测液中的标记抗体和反应膜检测区的包被抗体，应为相应检测指标对应的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是所述检测指标为抗体，则其检测液中的标记抗原和反应膜检测区的包被抗原，应为相应检测指标对应的基因工程重组抗原。
5.根据权利要求1所述用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是所述样品垫为玻璃纤维垫，吸水垫为普通吸水纸。
全文摘要
本发明提供了一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，该方法采用具体步骤是(1)量子点标记蛋白液的制备，(2)量子点标记蛋白检测液的制备，(3)制备包被有检测指标的反应膜，(4)在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，(5)定性或定量检测。这种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法是一种高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉、应用广泛的量子点荧光免疫层析试纸条快速检测方法。
文档编号G01N33/577GK103048460SQ20121054624
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月15日 优先权日2012年12月15日
发明者彭俊, 朱小波, 庞代文, 张志凌, 余慧 申请人:武汉珈源生物医学工程有限公司