专利名称：一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法
技术领域：
本发明涉及药物评价方法领域，具体涉及一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法。
背景技术：
随着中药现代化程度的提高，中药注射剂近年来有了很大发展，但随之而来的安全性问题也日益严重。临床前安全性评价方法中，中药注射剂过敏性试验包括主动全身过敏试验(ASA)和被动皮肤过敏试验(PCA)，主要针对I型过敏反应，但绝大部分中药注射剂在新药临床前申报资料中过敏性试验结果均为阴性，与上市后临床使用中存在的过敏反应高阳性率存在较大的差异，这种差异提示传统过敏性试验可能存在缺陷，因此，寻找更有效、灵敏的评价方法是目前亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明提供了一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，该方法对于中药注射剂的潜在致敏性的判定直观、稳定、可靠。一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，包括步骤(1)采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2H3细胞)建立中药注射剂潜在致敏性体外评价模型；(2)用透射电镜观察、计算脱颗粒指数、Armexin V阳性细胞率、β -己糖胺酶释放率中的一种或两种以上指标判定中药注射剂的潜在致敏性。所述的中药注射剂潜在致敏性体外评价模型的构建为大鼠嗜碱性细胞白血病细胞传代培养。所述的传代培养的方法采用现有的细胞传代培养方法。所述的脱颗粒指数采用常规形态学方法检测。所述的Armexin V阳性细胞率采用流式细胞术测定。所述的β -己糖胺酶(即β -氨基己糖苷酶)释放率采用分光光度法测定。本发明用于体外评价中药注射剂潜在致敏性采用了 RBL-2H3细胞来建立细胞模型。RBL-2H3细胞是商品化的大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株，表面有高亲和力IgE受体，活化后可以发生脱颗粒反应，由于其具有永生化特性，培养方法简单，生长迅速，避免了从血液中梯度分离嗜碱粒细胞时操作繁琐或细胞纯度、数量不足等弊端，是建立体外检测系统的最佳选择。本发明用于体外评价中药注射剂潜在致敏性采用了测定Armexin V阳性率的方法。Armexin V曾被广泛用于结合凋亡过程中质膜上的磷脂酰丝氨酸。许多实验证实 Annexin V参与胞吐过程。1999年，Demo首次报道用Armexin V来标记脱颗粒的肥大细胞， 结果显示，Armexin V特异性地与细胞表面的分泌颗粒结合，结合程度与β -己糖胺酶释放成正比。与现有技术相比，本发明具有如下优点
本发明将从脱颗粒指数、组胺释放率、Armexin V阳性率、β -己糖胺酶释放率等目前常用指标确定RBL-2H3细胞体外评价模型各项参数，建立方便快捷的中药注射剂临床前安全性评价或临床应用不良反应预测的有效平台。
图1为实施例2中Armexin V阳性率与CA浓度的关系图；图2为实施例2中对照组的流式散点图；图3为实施例2中CA浓度为0. 2mmol · Γ1药物组的流式散点图；图4为实施例2中CA浓度为1. Ommol · L—1药物组的流式散点图；图5为实施例2中CA浓度为5. Ommol · L—1药物组的流式散点图；图6为实施例4中阴性对照组RBL-2H3细胞的透射电镜图；图7为实施例4中阳性对照组RBL-2H3细胞的透射电镜图；图8为实施例4中CA浓度为0. 2mmol · L—1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图；图9为实施例4中CA浓度为1. Ommol · L—1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图；图10为实施例4中CA浓度为5. Ommol · L—1药物组RBL-2H3细胞的透射电镜图。
具体实施例方式本发明结合具体实施例进一步说明如下实施例1形态学方法检测脱颗粒指数大鼠RBL-2H3嗜碱粒细胞肿瘤株，购自中国科学院细胞库，用含10% (体积百分比)新生牛血清、40u ^mr1庆大霉素的DMEM培养液，于 37°C,5% (体积百分比)C02和饱和湿度的培养箱中传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。取对数生长期RBL-2H3细胞，消化计数，调整细胞悬液浓度为5. OX IO6个· mL—1， 3个药物处理组分别取50 μ 1细胞悬液置于0.5ml EP管中，加入50 μ 1不同浓度绿原酸供试液(溶剂为孵育缓冲液，孵育缓冲液中NaCl 140mmol/L, KCl 5mmol/L, CaCl2Immol/ L，MgCl2,0. 6mmol/L，其余为双蒸水)(绿原酸，以下简称CA)，绿原酸供试液浓度分别为 0. 2讓ol · !Al. (kimol · 1^、5. (kimol · Γ1 ；阴性对照组取 50 μ 1 细胞悬液置于 0. 5ml EP 管中，加入50 μ 1 DMEM培养液；阳性对照组取50 μ 1细胞悬液置于0.5ml EP管中，加入50 μ 1 浓度为30 μ g · πιΓ1的受试药物C48/80的孵育缓冲液。3个药物处理组、阴性对照组和阳性对照组均分别在37°C孵育30、60、120min，冰浴IOmin终止反应，然后分别加入150 μ 1阿利新蓝染液(每管细胞终浓度为1. 0 X IO6个^r1)，染色lOmin，混合均勻后显微镜下计数着色细胞，根据公式计算脱颗粒指数(DI)，并用MOTIC生物显微图像采集分析系统摄片。脱颗粒指数(DI)=[(阴性对照组着色细胞_药物处理组着色细胞)/阴性对照组着色细胞]X 100%。RBL-2H3细胞呈单层贴壁生长，在倒置相差显微镜下可见到胞浆内大量的异质性颗粒。本实验用阿利新蓝染色RBL-2H3细胞，观察到细胞为圆形，核不着色，细胞内有均勻分布的浅蓝色颗粒物质。RBL-2H3细胞脱颗�：螅赴⑸煌潭鹊谋湫危诳帕Ｏ∈瑁� 甚至出现空泡，胞浆颜色消退。观察者统一观察标准，调整细胞浓度后，在视野范围内对脱颗粒细胞进行计数，并根据公式计算得出脱颗粒指数(DI)，结果见表1。
表1绿原酸对RBL-2H3细胞脱颗粒指数的影响(X± SD, η = 5)
权利要求
1.一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，其特征在于，包括步骤(1)采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞建立中药注射剂潜在致敏性体外评价模型；(2)用透射电镜观察、计算脱颗粒指数、ArmexinV阳性细胞率、β -己糖胺酶释放率中的一种或两种以上指标判定中药注射剂的潜在致敏性。
2.根据权利要求1所述的用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，其特征在于，所述的中药注射剂潜在致敏性体外评价模型的构建为大鼠嗜碱性细胞白血病细胞传代培养。
3.根据权利要求1所述的用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，其特征在于，所述的脱颗粒指数采用常规形态学方法检测。
4.根据权利要求1所述的用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，其特征在于，所述的Armexin V阳性细胞率采用流式细胞术测定。
5.根据权利要求1所述的用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，其特征在于，所述的己糖胺酶释放率采用分光光度法测定。
全文摘要
本发明公开了一种用于体外评价中药注射剂潜在致敏性的实验方法，包括步骤(1)采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞建立中药注射剂潜在致敏性体外评价模型；(2)用透射电镜观察、计算脱颗粒指数、Annexin V阳性细胞率、β-己糖胺酶释放率中的一种或两种以上指标判定中药注射剂的潜在致敏性。本发明方法对于中药注射剂的潜在致敏性的判定直观、稳定、可靠。
文档编号G01N33/15GK102323386SQ20111015725
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者张信岳 申请人:浙江省医学科学院
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