亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫吸附和幽门螺旋杆菌临床诊断领域，尤其是一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)在1983年由澳大利亚医生发现,呈螺旋状，为革兰氏阴性菌，定殖于人胃部。幽门螺旋杆菌感染是引起人类消化道疾病的重要原因，能够导致慢性胃炎、严重萎缩性胃炎、消化道溃疡和胃癌相关。西方国家30-50%的人群感染过幽门螺旋杆菌，我国幽门螺旋杆菌感染率高达70-90%，随着年龄增长，感染率有增加的趋势。感染人群中的10%患者会出现临床症状，包括胃炎、胃十二指肠溃疡等，若不 接受抗菌素治疗，感染可持续终生，其中部分患者可能导致胃癌。目前检测幽门螺旋杆菌感染的方法较多，包括检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体、粪便中幽门螺旋杆菌的抗原、尿素呼气试验、定量PCR方法、细菌培养方法和病理学检测方法等，其中检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体，包括酶联免疫吸附试验、免疫印记和胶体金等方法，具有特异性高，能够定量分析的特点。但是试验中涉及的幽门螺杆菌抗原，为部分纯化的幽门螺旋杆菌全抗原，特异性、稳定性等方面，不能完全满足检测要求。本发明涉及幽门螺旋杆菌临床诊断试剂盒和检测方法，涉及抗原为幽门螺旋杆菌鞭毛蛋白、空泡毒素、细胞毒素相关蛋白和尿素酶等。鞭毛蛋白是幽门螺旋杆菌鞭毛的主要组成蛋白，是细菌运动的动力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性环境，对鞭毛具有保护作用，运动能力较强的菌株其致病性较高。空泡毒素VacA能够分泌到细菌外部，对胃上皮细胞造成损伤，产生空泡性病变，另外能够改变细胞膜的离子通透性，导致细胞整体病变。所有幽门螺旋杆菌存在VacA编码基因，但是只有约50 %的菌株表达VacA蛋白。细胞毒素相关蛋白(CagA)分子量为128kD，存在于60-70%的幽门螺旋杆菌菌株中，具有CagA为I型菌株，具有较强致病性，CagA阴性为II型菌株，致病性较弱，在胃炎患者中中，CagA抗体阳性率为70-75%，在十二指肠溃疡患者中，CagA抗体阳性率几乎为100%。尿素酶产生高浓度氨，导致细胞空泡病变。本发明使用上述6种纯化的重组毒力蛋白为抗原，采用酶联免疫吸附技术，测定标本中相应的抗体。

发明内容
本发明的目的是提供一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法，主要包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B的纯化重组蛋白作为抗原包被微孔板，检测标本中抗体的种类和数量。本发明实现目的的技术方案如下—种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白，所述底物为含有1% m/m 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺和30% v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。而且，所述微孔板为透明聚苯乙烯微孔板，微孔底部为平底。而且，所述纯化的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗原单独包被微孔，或混合包被微孔。而且，所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等。而且，所述洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。而且，所述酶标二抗为鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体。
一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法，步骤为将血清或血浆标本加入微孔中孵育，与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，孵育后再洗板，孵育后洗板，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，检测标本中抗体的种类和数量。本发明的有益效果和优点是本发明使用纯化的6种幽门螺杆菌重组毒力蛋白作为抗原，抗原本身具有高度保守性和特异性，且与患者的症状相关，因此，本试剂盒具有特异性高、区分幽门螺旋杆菌临床菌株毒力强弱、以及具有半定量检测的特点。


图I为本发明重组质粒的限制性内切酶图谱。使用的限制性内切酶分别为BamHI和Sail，图谱中1.3kb和2. 5kb的条带来自基因表达的辅助质粒pREP4，vector为克隆基因的载体，大小为3. 4kb，三角形代表克隆的基因片段，大小与预期相同，其中ureB基因的部分片段与载体片段连接在一起，大小与预期也相同；图2为本发明幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的PCR扩增产物分析，其中，IcagA，2vacA，3 ureA，4 ureB，5 flaA，6 flaB ；图3重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白表达与纯化结果分析，其中I CagA，2 VacA, 3FlaA，4FlaB，5 UreA,6 UreB0
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明为制备幽门螺旋杆菌重要毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法。试剂盒包括微孔板、细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A、尿素酶亚基B、鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体(酶标二抗)、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液、洗液和稀释液。微孔板包被上述6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白，可以分别包被，也可以混合包被。 检测时，血清或血浆标本与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，再洗涤，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，确定标本中相应抗体是否存在。所述底物为含有1% m/m3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)和30% v/v过氧化氢的溶液，所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等，所述洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。具体制备方法和检测方法如下一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的制备I、抗原包被微孔板微孔板材质为聚苯乙烯，微孔为透明平底。配置重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白溶液，溶液浓度为2-10 μ g/mL，使用磷酸盐缓冲液(lOmmol/L磷酸盐缓冲液pH 7. 4U50mmol/L氯化钠和O. I %叠氮化钠)或是碳酸钠缓冲液(pH 9. 4)，每孔加入100 μ L蛋白质溶液， 4-37 °C孵育数小时或过夜。2、封闭除去包被液,加入洗板液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7. 4、150mmol/L氯化钠和
O.05%吐温20)洗板3次，或用洗板机完成。每孔加入IOOyL封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH7. 4、150mmol/L氯化钠和5%牛血清白蛋白BSA)，37°C孵育30min。3、平板包装去除封闭液，用洗板液洗板3次，平板干燥后装入塑料袋或其它袋中，放入干燥剂封口保存。4、分装酶标二抗、阴性血清对照和阳性血清对照等。其中酶标二抗为市售，阴性血清为混合多份幽门螺旋杆菌阴性的健康人血清获得，阳性血清为混合多份幽门螺旋杆菌阳性的患者血清获得。二、幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法I、稀释标本用稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7. 4、150mmol/L氯化钠和O. 05%吐温20)稀释待测的血浆或血清I到200倍，混匀。2、加样用移液器分别取IOOyL液体，包括空白(稀释液)、阴性对照、阳性对照和稀释的标本等，置于已经包被好重组毒力蛋白的微孔板中，设置2-3个重复孔，盖好后37°C孵育30min。整个操作过程应该在IOmin内完成，避免误差的出现。3、洗板洗板3次，每次用350 μ L洗板液，弃掉洗涤液，在干净吸水纸上轻轻敲打微孔板几次，去除残余洗涤液。如果标本较多，可以利用洗板机完成洗板过程。4、酶标二抗标记用8通道移液器取100 μ L稀释100倍的二抗加入微孔板中，盖好后37°C温育30mino5、洗板洗板3次，每次用350 μ L洗板液，弃掉洗涤液，在干净吸水纸上轻轻敲打微孔板几次，去除残余洗涤液。如果标本较多，可以利用洗板机完成洗板过程。6、加入底物
用8通道移液器分别取100 μ LI %底物液3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液和10 μ L0. 3%过氧化氢加入孔中，开始计时，在室温(20-25°C )温育30min，避免直接光照。7、终止反应用8通道移液器取100 μ L终止液(100mmol/L硫酸)加入孔中，终止反应等待测定。8、测定结果在终止反应30min内，利用酶标仪测定结果，吸收波长为450nm。 9、结果的计算计算阳性对照和患者标本的平均吸光度值A，减去空白孔的平均吸光度值。按照下列公式计算酶联免疫单位(enzyme immunounits, EIU)10、结果的解释结果的判定标准为阴性< 30EIU，阳性彡30EIU计算值小于30EIU显示阴性结果，或者没有检测到幽门螺旋杆菌抗体，或者抗体水平低于检测的极限。计算值大于30EIU显示检测到幽门螺旋杆菌抗体，结果为阳性。为了保证检测的准确性，
标本EIU =，林 ^1'' X 100
Α|；πη—Aviin试剂盒提供的阴性对照和阳性对照应该在每次实验都要检测，并且应该获得预期的检测值。测量结果大于临界值，不代表存在抗体的数量。对于那些样品值接近临界值的患者，需要在一定时间内采取第2份样品。分别收集患者血清或血浆标本370份，检测幽门螺旋杆菌IgG抗体，与其它试剂盒对比分析结果显示，阳性符合率为95. 4%，阴性符合率为99. 0%。如表所示
商业试剂盒
检测结果---
阳性阴性合计标本数
阳性156 2 158阴性6 206 212
本发明试剂盒合计标本数162 208 370
阳性符合率96.3%
阴性符合率99.0%细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A、尿素酶亚基B、6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白的制备方法如下一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的扩增与克隆(I)利用BHI培养基液体培养幽门螺旋杆菌，IOOOOg离心5min收集细菌细胞；(2)利用TE缓冲液重悬细胞，加入O. 1% SDS破壁，然后加入10 μ g/mL蛋白酶K，37°C过夜消化，用苯酚氯仿抽提若干次至无白色膜状物存在，氯仿抽提一次，加入2. 5倍体积95%乙醇沉淀染色体DNA，IOOOOg离心IOmin弃上清，用70%乙醇洗涤一次，沉淀干燥后加入TE缓冲液重悬成为染色体DNA溶液；(3)扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因。扩增体系包括I μ L提取的幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板(O. I μ g)、4 μ L设计的扩增引物(20pmol/L)、10yL 缓冲液(IOX) ,8μ L dNTPs (2. 5mmol/L)、I μ L Taq DNA 聚合酶(2. 5u)和76 μ L ddH20。在PCR仪上进行扩增，扩增参数为I个循环95°C预变性5min35个循环95°C 变性 Imin 56 O 复性 Imin72 O 延伸 2minI 个循环72°C保温 IOmin。6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因大小不同，设计的引物保证特异性的同时，弓丨物加入了不同的限制性内切酶位点，保证扩增的基因能够亚克隆到表达载体质粒上，并且毒力蛋白编码基因与载体质粒上的组氨酸编码序列连接中不产生移码突变。6种毒力蛋白编码基因PCR扩增所用引物序列如表I所示。表I、扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的引物
For CagA-His fusion
UP-CagA-^amHI: 57-GGATCCAAAAATGGCAAAAATAAGGATTTCA-3 ’
Down-CagA-ML 5，-GTCGACATTCCTTAATCCTTTAAGATTTTTGGAA-3，
ForVacA-His fusion
UP-VacA-方謂HI: 5 -GGATCCACAACAAACACACCGCAAAATCAATC-3 ’
Down-VacA-ML 5，-GTCGACCACCATGCTTTGATTGCCGATAGC-3 ’
For UrcA-His fusion
UP-UreA-^amHI: 5，-GGATCCCACCCCAAAAGAGTTAGATAAGTTGA-3 ’
Down-UreA-ML 5，-GTCGACTTCATTTCTTACTCCTTAATTGTTTTTA-3，
For UrcB-His fusion
UP-UreB-^g/II: 5’-AGATCTGAAA AAG ATT AGC AGA AAA GAA TATG-3 ’
Down-UreB-ML 5，-GTCGACAAAATCCTAGAAAATGCTAAAGAGTTGAG-3 ’
For FlaA-His fusion
UP-FlaA-^amHI: 5 ’-GGATCCTCAGGTCAATACAAATATCAATGCGATG-3 ’
权利要求
1.一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白，所述底物为含有1% m/m 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺和30% v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。
2.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于所述微孔板为透明聚苯乙烯微孔板，微孔底部为平底。
3.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于所述纯化的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗原单独包被微孔，或混合包被微孔。
4.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等。
5.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于所述 洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
6.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于所述酶标二抗为鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体。
7.—种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤为将血清或血浆标本加入微孔中孵育，与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，孵育后再洗板，孵育后洗板，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，检测标本中抗体的种类和数量。
全文摘要
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白所述底物为含有1％m/m 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和30％v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。本发明使用纯化的6种幽门螺杆菌重组毒力蛋白作为抗原，抗原本身具有高度保守性和特异性，且与患者的症状相关，因此，本试剂盒具有特异性高、区分幽门螺旋杆菌临床菌株毒力强弱、以及具有半定量检测的特点。
文档编号G01N33/68GK102721815SQ20121011298
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者杨洪江, 金守光 申请人:天津天佛罗生物技术有限公司