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专利名称：一种抗体偶联物及其方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体偶联物及其方法，尤其涉及一种偶联效率高的抗体偶联物及其方法。
背景技术：
目前抗体的偶联技术相对不是很成熟，偶联过程中抗体的偶联效率比较低，偶联的乳胶颗粒大小不合适。主要存在以下弊端1.偶联条件的描述不够清晰，很难找到合适的偶联条件；2.偶联的方法比较多，很难从中找到合适的偶联方法；3.对乳胶颗粒的活化基团的要求比较宽泛，导致难以找到合适的用于偶联的基团；4.对偶联过程中各种缓冲液的描述不够清晰，导致偶联中各种离子的浓度难以把握；5.对偶联后乳胶的效果评价方法不统一，导致偶联效果的判断缺乏说服力。
现有的技术中，也存在不少缺点1.偶联效率低下，造成乳胶和抗体的大量浪费，使偶联的成本居高不下；2.偶联效率低下，导致检出的项目浓度范围达不到要求(如CRP、IgG, IgA等项目)；3.偶联的乳胶颗粒大小不合适，导致检测灵敏度达不到要求；4.整体的偶联效果差，不能保证偶联产品的稳定性，可靠性，重复性；5.对偶联后乳胶的效果评价不够方便和快速。

发明内容
为了解决以上技术问题，本发明通过设计一种全新的偶联方法，明确偶联过程中的各个条件，使偶联过程更容易实现，并用一种特殊的方法对偶联后的抗体活性进行评价。本发明提供了一种抗体偶联物，包括
①活化缓冲液0.05M、pH=5. 0-6. 0的MES缓冲液；
②反应缓冲液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液；
③终止液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液和0. 04M的Gly;其中，0. 04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液是指，在整个所述终止液中，磷酸盐缓冲液的浓度为0. 04M，pH为7. 0-8. 5 ；Gly为甘胺酸，占整个所述终止液中浓度为0. 04M ；
④封闭液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液和质量分数为0. 01%_1%BSA溶液；其中，磷酸盐缓冲液占整个所述封闭液中浓度为0. 04M, pH为7. 0-8. 5，质量分数为0. 01%-1%BSA溶液是指，BSA溶液占整个所述封闭液的质量分数为0. 01%-1% ；
⑤保存液0.02M、pH=7. 0-7. 8的Tris缓冲液；
⑥反应缓冲液0.02M, pH=7. 0-7. 5磷酸盐缓冲液、0. 15M的氯化钠和质量分数为
0.005%-0. 5%的十二烷基苯磺酸钠；0. 02M, pH=7. 0-7. 5磷酸盐缓冲液是指pH为7. 0-7. 5磷酸盐缓冲液占整个反应缓冲液的浓度为0. 02M，氯化钠占整个反应缓冲液的浓度为0. 15M，十二烷基苯磺酸钠占整个反应缓冲液质量分数为0. 005%-0. 5% ；
⑦乳胶带羧基乳胶颗粒。优选的，所述乳胶的粒径为60-80nm或者120_160nm。
本发明还提供了一种抗体偶联方法，包括以下几个步骤清洗乳胶、活化乳胶、偶联抗体、终止步骤、封闭步骤，以及，保存步骤。优选的，所述清洗乳胶步骤包括
1)将所述乳胶用所述活化缓冲液稀释至10mg/ml，离心后除去上层清液；再用所述活化缓冲液复溶沉淀至10mg/ml ；
2)将步骤I得到的溶液于4°C下离心后除去上层清液，再用所述活化缓冲液复溶沉淀至 10mg/ml。优选的，所述活化乳胶步骤包括
3)将步骤2得到的乳胶中，加入5-15倍于乳胶中羧基摩尔数的NHS和EDC，在室温下剧烈搅拌15-30min ； 4)将步骤3得到的溶液于4°C下离心，除去上层清液，用所述活化缓冲液将得到的沉淀复溶；
5)重复步骤4两次后，再在4°C下离心后除去上层清液，备用。优选的，所述偶联抗体步骤包括
6)将抗体用所述反应缓冲液稀释至l_6mg/ml；
7)用去离子水复溶步骤5得到的乳胶至浓度为10mg/ml;迅速将乳胶滴加至等体积稀释好的抗体中；
8)将步骤7得到的乳胶和抗体在室温下剧烈搅拌4-6小时。优选的，所述终止步骤包括
9)将步骤8得到的产品于4°C离心后，吸出上层清液，并将上清液放置到离心管中；
10)用所述终止液复溶离心后的沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml；
11)在室温下剧烈搅拌的条件下反应15-30min。优选的，所述封闭步骤包括
12)将步骤11得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液；
13)封闭液复溶沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml；
14)在4°C下，剧烈搅拌的条件2-4小时。优选的，所述保存步骤包括
15)将步骤14得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液；
16)用保存液复溶沉淀，使乳胶的浓度为lmg/ml；
17)保存液复溶后的乳胶即偶联后抗体的乳胶，所述保存条件为4°C、避光。本发明还提供了抗体偶联物在抗体偶联方法中的应用。本发明的有益效果是
1.本技术的发明改善了抗体的偶联条件，提高了抗体偶联的效率，且偶联过程中反应条件温和，对抗体的活性影响�。�
2.偶联后的抗体活性检测采用了直接加入样本,包括全血样本的方法,不必再对样本进行稀释，节约了检测所用的时间，提高了检测的效率；
3.乳胶颗粒采用60-80nm、120-160nm两种进行搭配，提高了检测的灵敏度；
4.偶联后的抗体各项性能好稳定性强，精密性高，灵敏度强。


图I是本发明实施例的线性范围图.
图2是本发明中表5的数据误差线。
具体实施例方式下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明 实施例I :
1、清洗乳胶，用0.05M、pH5. 5的MES缓冲液洗两次；所选择乳胶的大小为80nm ；
2、在洗好的乳胶中，加入10倍于乳胶-COOH摩尔数的NHS和EDC，在室温和剧烈搅拌的条件下反应30min ；
3、低温(4°C)离心后，弃去上清，用活化缓冲液复溶；并重复此步骤两次，最后一次离心后弃去上清,不复溶,备用；
4、抗体用0.04M, pH7. 2的磷酸盐缓冲液即反应缓冲液稀释至I. 2mg/ml ；
5、用去离子水复溶活化完成后的乳胶，浓度为10mg/ml并迅速将复溶后的乳胶滴加至等体积稀释好的抗体中；
6、在室温和剧烈搅拌的条件下反应4小时；
7、低温(4°C)离心后，吸出上清液，并将上清液放置到离心管中；用0.04M, pH7. 2的磷酸盐缓冲液+40mM的Gly即终止液复溶离心后的沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml ;在室温和剧烈搅拌的条件下反应30min ；
8、低温(4°C)离心后，弃去上清液；用0.04M, pH =7. 4的磷酸盐缓冲液+0. 1%BSA即封闭液复溶沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml ;在4°C和剧烈搅拌的条件下反应2小时；
9、低温(4°C)离心后，弃去上清液；用0.02M, pH=7. 4的Tris缓冲液即保存液复溶沉淀，使乳胶的浓度为lmg/ml。
实施例2
1)选择乳胶的大小为120nm。将所述乳胶用所述活化缓冲液稀释至10mg/ml，离心后除去上层清液；再用所述活化缓冲液复溶沉淀至10mg/ml ；
2)将步骤I得到的溶液于4°C下离心后除去上层清液，再用所述活化缓冲液复溶沉淀至 10mg/ml ；
3)将步骤2得到的乳胶中，加入5-15倍于乳胶中羧基摩尔数的NHS和EDC，在室温下剧烈搅拌15-30min ；
4)将步骤3得到的溶液于4°C下离心，除去上层清液，用所述活化缓冲液将得到的沉淀复溶；
5)重复步骤4两次后，再在4°C下离心后除去上层清液，备用；
6)将抗体用所述反应缓冲液稀释至l_6mg/ml；
7)用去离子水复溶步骤5得到的乳胶至浓度为10mg/ml;迅速将乳胶滴加至等体积稀释好的抗体中；
8)将步骤7得到的乳胶和抗体在室温下剧烈搅拌4-6小时；
9)将步骤8得到的产品于4°C离心后，吸出上层清液，并将上清液放置到离心管中；
10)用所述终止液复溶离心后的沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml；11)在室温下剧烈搅拌的条件下反应15-30min；
12)将步骤11得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液；
13)封闭液复溶沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml；
14)在4°C下，剧烈搅拌的条 件2-4小时；
15)将步骤14得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液；
16)用保存液复溶沉淀，使乳胶的浓度为lmg/ml；
17)保存液复溶后的乳胶即为偶联了抗体的乳胶，所述保存条件为4°C、避光。实施例3
偶联效率的验证①用紫外分光光度计260nm、280nm时的吸光度确定一条抗体的浓度标准曲线；②用紫外分光光度计260nm、280nm分别测偶联前后抗体的吸光度；③利用抗体浓度的标准曲线计算出偶联前后的抗体浓度；④用偶联后的抗体除以偶联前的抗体浓度，计算出百分比，然后用I减去计算出的百分比即得出偶联效率；⑤此种偶联方法的抗体偶联效率可以达到90%左右。表I :偶联效率
权利要求
1.一种抗体偶联物，其特征在于，包括 ①活化缓冲液0.05M、pH=5. 0-6. 0的MES缓冲液； ②反应缓冲液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液； ③终止液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液和0. 04M的Gly ；④封闭液0.04M、pH=7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液和质量分数为0. 01%-1%BSA溶液； ⑤保存液0.02M、pH=7. 0-7. 8的Tris缓冲液；⑥反应缓冲液0.02M、pH=7. 0-7. 5磷酸盐缓冲液、0. 15mM的氯化钠和质量分数为0.005%-0. 5%的十二烷基苯磺酸钠； ⑦乳胶带羧基乳胶颗粒。
2.如权利要求I所述的抗体偶联物，其特征在于，所述乳胶的粒径为60-80nm或者120_160nm。
3.—种如权利要求I或2所述的抗体偶联方法，其特征在于，包括以下几个步骤清洗乳胶、活化乳胶、偶联抗体、终止步骤、封闭步骤，以及，保存步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述清洗乳胶步骤包括 1)将所述乳胶用所述活化缓冲液稀释至10mg/ml，离心后除去上层清液；再用所述活化缓冲液复溶沉淀至10mg/ml ； 2)将步骤I得到的溶液于4°C下离心后除去上层清液，再用所述活化缓冲液复溶沉淀至 10mg/ml。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化乳胶步骤包括 3)将步骤2得到的乳胶中，加入5-15倍于乳胶中羧基摩尔数的NHS和EDC，在室温下剧烈搅拌15-30min ； 4)将步骤3得到的溶液于4°C下离心，除去上层清液，用所述活化缓冲液将得到的沉淀复溶； 5)重复步骤4两次后，再在4°C下离心后除去上层清液，备用。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述偶联抗体步骤包括 6)将抗体用所述反应缓冲液稀释至l_6mg/ml； 7)用去离子水复溶步骤5得到的乳胶至浓度为10mg/ml;迅速将乳胶滴加至等体积稀释好的抗体中； 8)将步骤7得到的乳胶和抗体在室温下剧烈搅拌4-6小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述终止步骤包括 9)将步骤8得到的产品于4°C离心后，吸出上层清液，并将上清液放置到离心管中； 10)用所述终止液复溶离心后的沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml； 11)在室温下剧烈搅拌的条件下反应15-30min。
8.如权利要求7所述的偶联方法，其特征在于，所述封闭步骤包括 12)将步骤11得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液； 13)封闭液复溶沉淀，使乳胶的浓度保持10mg/ml； 14)在4°C下，剧烈搅拌的条件2-4小时。
9.如权利要求8所述的偶联方法，其特征在于，所述保存步骤包括 15)将步骤14得到的产品于4°C离心下后，吸出上层清液；16)用保存液复溶沉淀，使乳胶的浓度为lmg/ml；17)保存液复溶后的乳胶即偶联抗体后的乳胶，所述保存条件为4°C、避光。
10.权利要求I至9中任一所述的抗体偶联物在抗体偶联方法中的应用。
全文摘要
本发明提供一种抗体偶联物及其方法，抗体偶联物包括①活化缓冲液0.05M、pH=5.0-6.0的MES缓冲液；②反应缓冲液0.04M、pH=7.0-8.5的磷酸盐缓冲液；③终止液0.04M、pH=7.0-8.5的磷酸盐缓冲液和0.04M的Gly；④封闭液0.04M、pH=7.0-8.5的磷酸盐缓冲液和质量分数为0.01%-1%BSA溶液；⑤保存液0.02M、pH=7.0-7.8的Tris缓冲液；⑥反应缓冲液0.02M，pH=7.0-7.5磷酸盐缓冲液、0.15M的氯化钠和质量分数为0.005%-0.5%的十二烷基苯磺酸钠；⑦乳胶带羧基乳胶颗粒。
文档编号G01N33/544GK102798709SQ20121029400
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者郑焕巍, 李华涛, 陈亚球 申请人:深圳市锦瑞电子有限公司