专利名称：前列腺癌的代谢特征的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症标志物。特别地，本发明提供在癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差别存在的代谢物和代谢物组。
背景技术：
前列腺癌(PCA)已经成为男性癌症致死的顶级杀手，仅次于肺癌，65岁以上男性摧患前列腺癌的概率高达 1/9 (Abate-Shen 和 Shen, Genes Devl4 :2410 [2000] ;Rui jter 等Endocr Rev, 20 :22[1999])。美国癌症协会估计，2001年大约有184，500的美国男性会诊断出前列腺癌，大约39，200患者会因前列腺癌死亡。通常使用直肠指诊和/或前列腺特异性抗原(PSA)筛查来诊断前列腺癌。升高的血清PSA水平能够表明存在PCA。所以将PSA作为前列腺癌标志物使用，因为其只由前列腺细胞分泌。健康的前列腺会产生稳定的PSA量-通常低于每毫升4毫微克，或“4”或更低的PSA读数-而癌症细胞则产生与癌症严重性相关的升高的PSA量。PSA水平达到4至10之间时，医生会认为患者疑似罹患前列腺癌，而PSA量高于50则可能表明肿瘤已经扩散到身体其他部位。当PSA或直肠检测表明癌症有很大可能存在时，使用经直肠超声(TRUS)绘制前列腺图像并显示任何可疑之处。使用前列腺多部位活检来确定是否存在前列腺癌。治疗选择取决于癌症的发展阶段。对有10年或更短存活期的男性患者，其具有低格里森指数并且肿瘤未扩散到前列腺之外，通常采用观察治疗(不治疗)。对较高侵入性癌症的治疗选择包括外科治疗，诸如根治性前列腺切除术(RP)，这种治疗将完全切除前列腺(采用或不采用神经保留技术)，和放射治疗，通过使用从体外直接向前列腺照射剂量的外束或通过植入前列腺内的低剂量放射性粒子来局部杀灭癌细胞。也采用抗雄激素治疗，单独使用或与外科治疗或放射治疗联合使用。激素治疗使用黄体生成素释放激素(LH-RH)类似物，其阻碍脑垂体产生激素刺激睾酮的产生。患者必须终生注射LH-RH类似物。外科治疗和激素治疗通常对局部PCA有效，但对进展恶化的疾病没有实质性作用。雄激素切除术是治疗进展恶化的PCA最常用的疗法，其导致依赖雄激素的恶性癌细胞的大量细胞凋亡和暂时的肿瘤退化。然而在大多数实例中，肿瘤会报复性重现，而且能够不依赖雄激素的信号独立增殖。前列腺特异性抗原(PSA)筛查已经实现了 PCA的较早期诊断并极大地降低了 PCA相关的死亡数量。然而，还未有前瞻性随机报告研究结果显示PSA筛查对癌症特异性死亡率的影响(Etzioni 等 J. Natl. Cancer Inst. ,91 :1033 [1999] ；Maattanen 等 Br. J. Cancer79 :1210 [1999] ;Schroder 等 J. Natl. Cancer Inst. ,90 1817 [1998]) 血清 PSA 检验的主要局限是特别在PSA检测的中间范围(4至10ng/ml)缺乏对前列腺癌敏感度和特异性。在诸如前列腺良性增生(BPH)和前列腺炎这样的非恶性病状的患者体内，经常检测到升高的血清PSA水平，而且无法得知检测到的癌症的侵入性。与增加的血清PSA检测一致，实施前列腺穿刺活检数量也显著增加了(Jacobsen等JAMA 274 :1445[1995])。这导致大量�：那傲邢俅┐袒罴旖峁�(Epstein和Potter J. Urol.，166 :402 [2001])。因此，需要研究出其他的血清和组织的生物标志物来完善PSA筛查。
发明内容
本发明涉及癌症标志物。特别地，本发明提供在癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差别存在的代谢物和代谢物组。·例如，在某些实施方案中，本发明提供诊断前列腺癌或乳腺癌的方法，包括检测受试者的样本(例如,组织(例如,活检)样本、血液样本、血清样本或尿液样本)中的一种或多种(例如，2种或多种、3种或多种、5种或多种、10种或多种等。以多重或组形式一起测量)的癌症特异性代谢物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(例如、腐胺、牙精胺、精胺))的存在或缺失；和基于癌症特异性代谢物的存在或缺失诊断前列腺癌或乳腺癌。在某些实施方案中，癌症特异性代谢物在癌症样本中存在，而在非癌症样本中缺失。在某些实施方案中，癌症特异性代谢物在癌症样本中缺失，而在非癌症样本中存在。在某些实施方案中，检测一种或多种其他的癌症标志物(例如，以组或多重形式)和癌症特异性代谢物。在某些实施方案中，本发明提供一种诊断前列腺癌的方法，包括检测受试者的尿液样本中的肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平；和当肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平相对于非癌症受试者升高时诊断前列腺癌。在某些实施方案中，该方法还包含检测一种或多种代谢物水平的步骤，该代谢物选自例如，乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、马来酸盐、组氨酸、瓜氨酸、腺苷和肌苷。本发明进一步提供鉴定前列腺癌或乳腺癌的方法，包括检测诊断出癌症的受试者样本(例如，组织样本、血液样本、血清样本、尿液样本、尿沉渣样本)中的升高水平的癌症特异性代谢物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺))的存在或缺失；并基于癌症特异性代谢物的存在或缺失鉴定前列腺癌或乳腺癌。在某些实施方案中，在样本中升高水平的脂肪酸(例如，到肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)的存在表明受试者体内存在侵入性前列腺癌。在某些实施方案中，在样本中升高水平的哌可酸的存在表明受试者体内存在侵入性前列腺癌。在某些实施方案中，在前列腺组织样本(例如，前列腺活检样本)中降低水平的一种或多种聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺)的存在显示存在前列腺癌。在某些实施方案中，尿液样本中升高水平的一种或多种聚胺(例如，腐胺、牙精胺、精胺)的存在表明存在前列腺癌。在指定实施方案中，本发明提供一种诊断乳腺癌的方法，包括检测受试者的样本中一种或多种癌症特异性代谢物，诸如哌可酸、丝氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；基于癌症特异性代谢物的存在或缺失诊断乳腺癌。在某些实施方案中，聚胺是诸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些实施方案中，脂肪酸类型诸如肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸。在某些实施方案中，样本类型是诸如组织样本、血液样本、血清样本和尿液样本。在某些实施方案中，组织样本是活检样本。在某些实施方案中，一种或多种癌症特异性代谢物在癌症样本中存在，而在非癌症样本中缺失。在某些实施方案中，一种或多种癌症特异性代谢物在癌症样本中缺失，但在非癌症样本中存在。在某些实施方案中，该方法包括同时检测一种以上的所述癌症特异性代谢物的存在或缺失。在某些实施方案中，本发明提供一种鉴定乳腺癌的方法，包括在受试者的样本中检测一种或多种癌症特异性代谢物诸如哌可酸、丝氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；和基于癌症特异性代谢物的存在或缺失鉴定乳腺癌。在某些实施方案中，聚胺是诸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些实施方案中，脂肪酸是诸如肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸的脂肪酸。在某些实施方案中，样本类型诸如组织样本、血液样本、血清样本和尿液样本。在某些实施方案中，组织样本是活检样本。在某些实施方案中，样本中一种或多种升高水平的癌症特异性代谢物的存在表明受试者体内存在乳腺癌。在某些实施方案 中，样本中一种或多种降低水平的癌症特异性代谢物的存在表明受试者体内存在乳腺癌。在某些实施方案中，方法包括同时检测一种以上的癌症特异性代谢物的存在或缺失。在指定实施方案中，本发明提供一种诊断前列腺癌的方法，包括检测受试者的尿液样本中一种或多种癌症特异性代谢物诸如哌可酸、丝氨酸、聚胺和脂肪酸的存在或缺失；和基于在尿液样本中的癌症特异性代谢物的存在或缺失诊断前列腺癌。在某些实施方案中，聚胺是诸如腐胺、牙精胺和精胺的聚胺。在某些实施方案中，脂肪酸是诸如肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸的脂肪酸。在某些实施方案中，尿液样本是尿沉渣样本。在某些实施方案中，一种或多种癌症特异性代谢物在癌症样本中存在，而在非癌症样本中缺失。在某些实施方案中，一种或多种癌症特异性代谢物在癌症样本中缺失，而在非癌症样本中存在。在某些实施方案中，该方法包括同时检测一种以上癌症特异性代谢物的存在或缺失。在指定实施方案中，本发明提供一种诊断前列腺癌的方法，包括检测前列腺组织样本中一种或多种降低水平的聚胺；和基于在前列腺组织样本中一种或多种降低水平的聚胺诊断前列腺癌。在某些实施方案中，前列腺组织样本是活检样本。在某些实施方案中，聚胺类型诸如腐胺、牙精胺和精胺。在指定实施方案中，本发明提供一种诊断前列腺癌的方法，包括检测尿液样本中一种或多种升高水平的聚胺；和基于在尿液样本中一种或多种降低水平的聚胺诊断前列腺癌。在某些实施方案中，尿液样本是尿沉渣样本。在某些实施方案中，聚胺类型诸如腐胺、牙精胺和精胺。在另一些实施方案中，本发明提供用于检测代谢物的水平的组合物、试剂盒和系统。在某些实施方案中，试剂盒和系统包含必要组件，其足以或有效检测出代谢物的水平。本发明的其他实施方案在以下说明和实验部分详细描述。
图I示出了谷氨酸的水平在局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中更高。图2示出了甘氨酸的水平在局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中更高。图3示出了半胱氨酸的水平在局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中更高。图4示出了胸腺嘧啶的水平在转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中更高图5示出了哌可酸的水平在转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中
更高。 图6示出了尿嘧啶的水平在局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中比在良性前列腺组织中更高。图7示出了丝氨酸的水平在良性、局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中没有变化。图8示出了哌可酸的水平在侵入性前列腺癌细胞系(VCAP、Dul45和2RVV1)中比非侵入性前列腺细胞系(RWPE)中更高。图9示出了侵入性前列腺癌细胞系(LnCaP、Dul45、PC3、2RVVl)比非侵入性前列腺细胞系(RWPE)具有更高水平的尿嘧啶。图10示出了前列腺活检阳性患者的尿沉渣样本显示比来自前列腺活检阴性患者的尿沉渣样本具有更高的肌氨酸水平。图11示出了前列腺活检阳性患者的尿沉渣样本显示比来自前列腺活检阴性患者的尿沉渣样本具有更高的谷氨酸水平。图12示出了前列腺活检阳性患者的尿沉渣样本显示比来自前列腺活检阴性患者的尿沉渣样本具有更高的甘氨酸水平。图13示出了前列腺活检阳性患者的尿沉渣样本显示比来自前列腺活检阴性患者的尿沉渣样本具有更高的半胱氨酸水平。图14示出了前列腺活检阳性患者的尿沉渣样本显示与来自前列腺活检阴性患者的尿沉渣样本具有同等的甲硫氨酸水平。图15示出了表明在前列腺活检阳性的尿沉渣样本中的谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平比前列腺活检阴性对照更高的箱线图。图16示出了转移性前列腺组织样本比良性和局部前列腺癌样本具有更低的精胺水平。图17示出了转移性前列腺组织样本比良性和局部前列腺癌样本具有更低的腐胺水平。图18示出了转移性前列腺组织样本比良性和局部前列腺癌样本具有更低的牙精胺水平。图19示出了在良性、局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中精胺、腐胺和牙精胺水平的箱线图。图20示出了非侵入性前列腺细胞系(RWPE)显示比侵入性前列腺癌细胞系(VCAP、LnCaP、DU145、PC3和2RVV1)更高的精胺、腐胺和牙精胺水平。图21示出了精胺/甲硫氨酸之比在活检阳性前列腺癌患者的尿沉渣样本中比活检阴性对照中更高。图22示出了牙精胺/甲硫氨酸之比在活检阳性前列腺癌患者的尿沉渣样本中比活检阴性对照中更高。图23示出了在活检阳性前列腺癌患者和活检阴性对照的尿沉渣样本中精胺/甲硫氨酸和牙精胺/甲硫氨酸之比的箱线图。图24示出了肉豆蘧酸的水平在局部和转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中更高。图25示出了棕榈酸的水平在局部和转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中 更高。图26示出了花生四烯酸的水平在局部和转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中更高。图27示出了硬脂酸的水平在转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中更高。图28示出了月桂酸的水平在转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中更高。图29示出了油酸的水平在转移性前列腺癌组织样本中比在良性对照中更高。图30示出了表明棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸和月桂酸在良性、局部癌症和转移性前列腺癌组织样本中的水平箱线图。图31示出了在乳腺癌组织样本中比在良性组织样本中具有更高的水平。图32示出了侵入性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、BT-549、T578、SVM-245)具有比非侵入性细胞系(HME)更高的肌氨酸水平。图33示出了侵入性乳腺癌细胞系(MCF7、MDA-MB-231、T470、SKBR3)具有比非侵入性细胞系(MCFlOA)更高的腐胺、牙精胺和精胺水平。图34示出了显示在70个指诊后尿沉渣中(35Bx_ve和35Bx+ve)基于GC-MS分析的代谢物(肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)水平的箱线图。图35示出了在包含4种代谢物(肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)的70个尿沉渣训练集上使用回归分析发展的多重组的ROC曲线。图36示出了显示基于前列腺癌组织中的GC-MS分析的代谢物水平的箱线图。图37示出了前列腺癌组织显示较高的亮氨酸水平。图38示出了前列腺癌组织显示较高的天冬酰胺水平。图39示出了前列腺癌组织显示较高的色氨酸水平。图40示出了前列腺癌组织显示较高的犬尿胺酸水平。图41示出了前列腺癌组织显示较高的3-氨基丁酸水平。图42示出了活检阳性尿沉渣显示升高的肌氨酸水平。图43示出了活检阳性尿沉渣显示较高的尿嘧啶水平(尿嘧啶/丙氨酸的比)。图44示出了肌氨酸的再生性(独立制备)。图45示出了肌氨酸的再生性(复制)。图46示出了在指诊后尿沉渣中肌氨酸的稳定性。图47示出了在两次独立制备中谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的可再生性。
定义为了便于理解本发明，以下限定一些术语和短语“前列腺癌”是指癌症发生在前列腺部位的疾病，前列腺是指男性生殖系统中的腺体。“低级”或“较低级”的前列腺癌是指非转移性前列腺癌，包括低转移潜力的恶性肿瘤(例如，认为是具有低侵入性的前列腺癌)。“高级”或“较高级”前列腺癌是指在受试者体内已经转移的前列腺癌，包括高转移潜力的恶性肿瘤(认为是具有侵入性的前列腺癌)。如本文所使用的，术语“癌症特异性代谢物”是指在癌症细胞中与在非癌症细胞中相比差别存在的代谢物。例如，在某些实施方案中，癌症特异性代谢物在癌症细胞中存在，而在非癌症细胞中缺失。在其他的实施方案中，癌症特异性代谢物在癌症细胞中缺失，但在非癌症细胞中存在。在更进一步的实施方案中，癌症特异性代谢物在癌症细胞中与在非癌症细胞中相比差别存在。例如，癌症特异性代谢物可能以任何水平差别存在，但一般以升高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多的水平存在，或一般以降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% (例如，缺失)的水平存在。癌症特异性代谢物优选地以统计性显著(例如，通过使用Welch的T检验或Wilcoxon的秩和检验确定的P值小于O. 05和/或q值小于O. 10)的水平差别存在。典型的癌症特异性代谢物在以下说明和实验部分详细描述。如本文所使用的，术语“样本”以其最广义的含义使用。在一个含义中，其是指包括标本或从任何源获得的培养物，以及生物学和环境样本。生物学样本可以从动物(包括人类)中获得，而且包括流体、液体、组织和气体。生物学样本包括血液制品，诸如血浆、血清等等。然而，这种实例不能解释为限制本发明可用的样本类型。生物学样本可以是动物(包括人类)、流体、液体(例如，粪便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品，以及配料诸如乳品项目、蔬菜、肉类和肉类副产品以及废料。生物学样本可以从全部家族种类的家畜以及野化和野生动物中获得，这些动物包括但不限于诸如蹄类动物、熊、鱼、兔类动物、啮齿动物等。生物学样本可以含有任何适合检测所需生物标志物的生物学材料，而且可以包含来自受试者的细胞和/或非细胞的材料。该样本能够从任何适合的生物学组织或流体，例如，前列腺组织、血液、血浆、尿液或脑脊髓液(CSF)中分离。代谢物的“参考水平”是指显示特殊疾病状态、表型或其缺陷，以及疾病状态、表型或其缺陷的组合的代谢物水平。代谢物的“阳性”参考水平是指显示特殊疾病状态或表型的水平。代谢物的“阴性”参考水平是指显示缺乏特殊疾病状态或表型的水平。例如，代谢物的“前列腺癌阳性参考水平”是指显示受试者体内前列腺癌的阳性诊断的代谢物水平，而且代谢物的“前列腺癌阴性参考水平”是指显示受试者体内前列腺癌阴性诊断的水平。代谢物的“参考水平”可以是代谢物的绝对或相对量或浓度、代谢物的存在或缺失、代谢物的量或浓度范围、代谢物的最小和/或最大量或浓度、代谢物的平均量或平均浓度，和/或代谢物的中值量或中值浓度；而且，此外，代谢物的组合的“参考水平”还可以是两种或多种代谢物彼此的绝对或相对量的比例。对特殊疾病状态、表型或其缺陷的代谢物的适当阳性和阴性参考水平可以通过在一种或多种适当受试者体内测量所需代谢物的水平来确定，而且这种参考水平可以根据受试者具体群体来调整(例如，参考水平可以与年龄匹配以便可以在特定年龄的受试者样本中的代谢物水平和对特定年龄群的特殊疾病状态、表型或其缺陷的参考水平之间作比较)。这种参考水平还可以根据用于测量生物学样本(例如，LC-MS、GC-MS等)的代谢物水平的具体技术来调整，其中代谢物的水平可以根据使用的具体技术而不同。如本文所使用的，术语“细胞”是指任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、两栖类动物细胞、植物细胞、鱼细胞核昆虫细胞)，不论是位于体外或体内。“质谱测定法”(MS)是测量和分析分子的技术，其包括分割靶分子，然后基于它们的质荷比分析碎片以产生质谱，作为“分子指纹”。通过确定波长的方式确定对象的质荷比，其中由该对象吸收电磁能量。有几种确定离子质荷比的常用方法，某些方法使用电磁波测 量离子轨道的相互作用，其他方法测量离子行进特定距离的时间，或两者都有。能够在数据库中查询来自这些碎片质量测量的数据以获得靶分子的确切鉴定。质谱测定法还广泛应用于化学的其他领域，诸如石油化学或药品质量控制等其他领域。术语“代谢”是指在有机体组织内发生的化学变化，包括“合成代谢”和“分解代谢”。合成代谢是指分子的生物合成或聚集，而分解代谢是指分子断裂。“代谢物”是中间的或源自代谢的产物。代谢物通常是指“小分子”。术语“代谢学”是指分子代谢物研究。“生物聚合物”是一种或多种类型的重复单位的聚合物。生物聚合物通常在生物系统中出现，特别包括多糖(诸如碳水化合物)和多肽(其术语用于包括多肽和蛋白质)和多核苷酸及其类似物，诸如那些由氨基酸类似物或非氨基酸基团，或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成，或包含这些产物的化合物。这包括多核苷酸，其中常规主链由非天然产生或合成主链替代，和核酸(或合成或天然产生的类似物)，其中一种或多种常规碱基已经由能够参与Watson-Crick型氢键相互作用的基团(天然或合成的)替代。多核苷酸包括单链或多链配置，其中一条或多条链可以或可以不是彼此完全排成一列的。如本文所使用的，术语“术后组织”是指已经在外科流程中从受试者体内移除的组织。术后组织的实例包括但不限于活检样本、切除的器官和切除的器官部分。如本文所使用的，术语“检测(detect) ”、“检测(detecting)”或“检测(detection) ”可以描述为发现或鉴定的一般行为，或可检测标记成分的具体观察。如本文所使用的，术语“临床失败”是指前列腺切除术之后的负面结果。与临床失败相关的结果实例包括但不限于前列腺切除术之后的PSA水平升高(例如，上升至少O. 2ng/ml)或疾病复发(例如，转移性前列腺癌)。如本文所使用的，术语“多重”是指同时检测样本中一种以上的物质(例如，分析物、代谢物、化合物)。发明详述本发明涉及癌症标志物。特别地实施方案，本发明提供在癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差别存在的代谢物。在研究本发明实施方案过程中操作的实验辨识出，例如，肌氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、乙酰氨基葡糖、高半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、正乙酰天门冬氨酸、马来酸盐、瓜氨酸、肌苷、肌醇、腺苷、牛磺酸、肌酸、尿酸、谷胱甘肽、尿嘧啶、犬尿氨酸、甘油-3-磷酸、甘氨胆酸、辛二酸、胸腺嘧啶、谷氨酸、丝氨酸、尿嘧啶、黄苷、4-乙酰胺基丁酸、哌可酸、棕榈酸、硬脂酸、月桂酸、油酸、花生四烯酸、甲硫氨酸、精胺、色氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基异丁酸、牙精胺、腐胺、肉豆蘧酸和胸腺嘧啶差别存在于罹患癌症的受试者体内。其他标志物在本文中和WO 2009/026152以及W02008/036691中描述，它们的全部内容通过弓I用纳入本文。公开的标志物作为诊断、调查、筛查和治疗目的使用。在某些实施方案中，本发明提供诊断癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明提供基于升高水平的代谢物的存在鉴定侵入性癌症(例如，侵入性前列腺癌、侵入性乳腺癌)的方法。本发明的实施方案提供组(例如，包含2种或多种、5种或多种、10种或多种、25种或多种或50种或多种)标志物用于诊断、预断、筛查或治疗应用 诊断和筛查应用在某些实施方案中，本发明提供诊断和筛查癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)的方法和组合物，包括但不限于基于癌症特异性代谢物或其衍生物、前提、代谢物等的存在，鉴定或诊断癌症风险、癌症阶段的存在或缺失、转移的风险或存在、癌症的侵入性等。典型的诊断方法描述如下。样本根据本文的方法测验任何疑似含有癌症特异性代谢物的患者样本。通过非限制性的实施例，该样本可以是组织(例如，前列腺或乳腺活检样本或术后组织)、血液、尿液或其部分(例如，血浆、血清、尿上清液、尿细胞沉淀、尿沉渣或前列腺细胞)。在某些实施方案中，样本是从活检或手术后(例如，前列腺活检)获得的组织样本。尿液样本优选地在留意的直肠指检(DRE)后立即收集，其使得前列腺细胞从前列腺腺体流进尿道中。在某些实施方案中，患者样本经过用于对癌症特异性代谢物或含有癌症特异性代谢物的细胞分离或培养样本的预处理。可以使用对本领域一般技术人员已知的多种技术达到此目的，这些技术包括但不限于离心、免疫捕捉和细胞裂解。代谢物的检测可以使用任何合适的方法检测代谢物，这些方法包括但不限于液相和气相色谱法、单独或耦合进行质谱测定法(参见例如，以下实验部分)、NMR(参见例如，美国专利公开文本20070055456，通过引用纳入本文)、免疫测定、化学测定、分光镜检查诸如此类。在某些实施方案中，使用色谱法和NMR分析的商业系统。在其他的实施方案中，使用光学成像技术检测代谢物(例如，生物标志物及其衍生物)，诸如磁共振波谱(MRS)、磁共振成像(MRI)、CAT扫描、超声、基于MS的组织成像或X射线检测方法(例如，能量色散X射线荧光检测)。可以使用任何合适的方法分析生物学样本以确定样本中一种或多种代谢物的存在、缺失或水平。合适的方法包括色谱法(例如，HPLC、气相色谱法、液相色谱法)、质谱测定法(例如，MS、MS-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、其他免疫化学技术、生物化学或酶促反应或测定及其组合。此外，可以间接测量一种或多种代谢物的水平，例如通过使用测量与所需测量的生物标志物水平相关的化合物(或化合物)水平测定。可以使用本发明的方法确定一种或多种列举的代谢物水平。例如，可以使用这些方法确定一种代谢物、2种或多种代谢物、3种或多种代谢物、4种或多种代谢物、5种或多种代谢物、6种或多种代谢物、7种或多种代谢物、8种或多种代谢物、9种或多种代谢物、10种或多种代谢物等的水平，包括本文所述的某些或全部代谢物的组合的水平。确定代谢物组合的水平可以允许方法中存在更多敏感度和特异性，诸如诊断前列腺癌和辅助诊断前列腺癌，而且可以允许更好的鉴别或鉴定前列腺癌，使之与前列腺其他疾病(例如良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎等)或可能与前列腺癌具有相似或重叠代谢物的其他癌症(比较未罹患前列腺癌的受试者)区分开。例如，生物学样本中特定代谢物水平比例可以允许在诊断前列腺癌和辅助诊断前列腺癌的过程中具有更大敏感度和特异性，并允许更好地鉴别或鉴定前列腺癌，使之与前列腺其他疾病或可能与前列腺癌具有相似或重叠代谢物的其他癌症(比较未罹患前列腺癌的受试者)区分开。在某些实施方案中，发现一种或多种代谢物(例如，哌可酸或脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸))的水平用于鉴定或鉴别乳腺癌。
数据分析在某些实施方案中，使用基于计算机的分析程序将由检测试验生成的原始数据(例如，癌症特异性代谢物的存在、缺失或量)为临床医师解释成预测值数据。临床医师能够使用任何合适的方法访问预测数据。因此，在某些实施方案中，本发明具有进一步优势，未经过代谢物分析训练的临床医师不需要理解原始数据。数据以其最有效的形式直接显示给临床医师。然后临床医师能够立刻使用信息以优化对受试者的治疗方案。本发明考虑到任何能够接收、处理和传输信息的方法，这些信息来自实验室进行分析的信息、提供的信息、来自医务人员和受试者的信息。例如，在本发明的某些实施方案中，样本(例如，活检或血液、尿液或血清样本)从受试者体内获得并提交到分析系统中(例如，医疗设施的临床实验室等。)，其位于世界的任何地方(例如，位于与受试者居住国家不同的国家或信息最终使用的国家)以生成原始数据。如果样本包含组织或其他生物学样本，受试者可以去医疗中心获取样本并发送到分析中心，或受试者可以自己收集样本(例如，尿液样本)并直接发送到分析中心。如果样本包含之前确定的生物学信息，受试者可以直接发送信息到分析中心(例如，含有信息的信息卡可以通过计算机扫描，并使用电子通讯系统将数据传输到分析中心的计算机上)。一旦分析中心接收信息，处理样本，产生特异于受试者所需的诊断或预后信息的分析文件(例如，代谢特征)。然后由治疗的临床医师将分析数据制成适合转译的格式。例如，并非提供原始数据，制成的格式可以表现出对受试者的诊断或风险评估(例如，存在癌症的可能性)，以及对特别治疗选择的建议。数据可以通过任何合适的方法显示给临床医师。例如，在某些实施方案中，分析系统产生报告，由临床医师(例如，在治疗点上)打印或系统显示给计算机监控的临床医师。在某些实施方案中，信息在治疗点上或在局部设施上首先分析。然后将原始数据发送到中央处理设施以作进一步分析和/或以将原始数据转换成对临床医师或患者有用的信息。中央处理设施具有隐私保密(所有数据按照统一的安全协议存储在中央设施中)、速度和数据分析一致性的优势。然后中央处理设施在治疗受试者之后能够控制的命运。例如，使用电子通讯系统，中央处理设施能够提供数据给临床医师、受试者或研究者。在某些实施方案中，受试者能够使用电子通讯系统直接获取数据。受试者可以根据结果选择进一步干预或咨询。在某些实施方案中，数据用于调查使用。例如，数据可以用于进一步优化包含或清除作为疾病的特殊状况或阶段的有效指示物的标志物。在某些实施方案中，代谢物升高或降低的水平(例如，相对于在正常前列腺细胞中的水平、相对于先前时间点水平上升、相对于预先建立的阈水平上升等。)表明样本中存在癌症。当确定样本中一种或多种代谢物的量或水平时，这种量或水平可以与癌症代谢物参考水平比较，诸如癌症阳性和/或癌症阴性参考水平，以便辅助诊断或诊断受试者是否罹患癌症。样本中一种或多种代谢物的水平对应于癌症阳性参考水平(例如，与参考水平相同的水平、与参考水平大体上相同的水平、高于和/或低于最小和/或最大参考水平的水平、和/或在参考水平范围内的水平)表明受试者体内存在癌症的诊断。样本中一种或多种代谢物的水平对应于癌症阴性参考水平(例如，与参考水平相同的水平、与参考水平大 体上相同的水平、高于和/或低于最小和/或最大参考水平的水平、和/或在参考水平范围内的水平)表明受试者体内没有癌症的诊断。此外，样本中差别存在的一种或多种代谢物的水平(特别在统计上显著的水平上)与癌症阴性参考水平相比，表明受试者体内存在癌症的诊断。样本中差别存在的一种或多种代谢物的水平(特别在统计上显著的水平上)与癌症阳性参考水平相比，表明受试者体内没有癌症的诊断。使用多种技术，一种或多种代谢物的水平与癌症阳性和/或前列腺癌阴性参考水平比较，包括在生物学样本中一种或多种代谢物水平与癌症阳性和/或癌症阴性参考水平的简单比较(例如，手动比较)。还可以使用一种或多种统计分析(例如，t检验、Welch的T检验、Wilcoxon的秩和检验、随机森林)比较在生物学样本中一种或多种代谢物水平与癌症阳性和/或癌症阴性参考水平。组合物&试剂盒用于(例如，足以用于、必须用于或有效用于)本发明的某些实施方案的诊断、调查或筛查方法的组合物包括必须、足以或有效用于检测癌症特异性代谢物存在或缺失的试齐U。所有这些组合物，单独或与本发明的其他组合物结合，可以以试剂盒的形式提供。试剂盒还可以包含适当的控制器和/或检测试剂。组本发明的实施方案提供同时检测一种或多种本发明标志物(例如，肌氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、正乙酰天门冬氨酸、肌苷、肌醇、腺苷、牛磺酸、肌酸、尿酸、谷胱甘肽、尿嘧啶、犬尿氨酸、甘油-3-磷酸、甘氨胆酸、辛二酸、胸腺嘧啶、谷氨酸、黄苷、4-乙酰胺基丁酸、正乙酰酪氨酸和胸腺嘧啶、哌可酸、脂肪酸(包括但不限于肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸、油酸)或聚胺(包括但不限于腐胺、牙精胺、精胺))的多重或组测定，检测包括单独检测上述标志物，或与本领域已知的其他癌症标志物结合检测。例如，在某些实施方案中，提供组或结合测定在单独测定中检测2种或多种、3种或多种、4种或多种、5种或多种、6种或多种、7种或多种、8种或多种、9种或多种、10种或多种、15种或多种或20种或多种的标志物。在某些实施方案中，测定是自动化或高流通量的。
在某些实施方案中，组包含肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。实验在本发明实施例的研究过程中施行，确定肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的组显示比任何单个标志物更高的曲线下面积，因此在检测前列腺癌症中更具敏感性。在某些实施方案中，检测前列腺癌的组进一步包含一种或多种乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、马来酸盐、组氨酸、瓜氨酸、腺苷或肌苷。在某些实施方案中，其他癌症标志物包括在多重或组测定中。标志物选自其单独的或与本文所述的代谢标志物结合的预测值。典型的前列腺癌标志物包括但不限于AMACR/P504S (美国专利号 6，262，245) ；PCA3 (美国专利号 7，008，765) ；PCGEM1 (美国专利号 6，828，429) ;prostein/P501S、P503S、P504S、P509S、P510S、前列腺 /P703P、P710P(美国公开号20030185830);和那些在美国专利号5，854，206和6，034，218以及美国公开号20030175736中公开的信息，它们的全部内容通过引用纳入本文。也考虑到到其他癌症、疾病、感染和代谢状况的标志物，将其包括在多重或组形式中。治疗方法·在某些实施方案中，本发明提供一种治疗方法(例如，靶定本文所述癌症特异性代谢物)。在某些实施方案中，该治疗方法靶定本文所述癌症特异性代谢物的酶或通路的组成部分。例如，在某些实施方案中，本发明提供靶定本发明的癌症特异性代谢物的化合物。化合物可以通过，例如干扰癌症特异性代谢物或其前体或代谢物的合成(例如，通过阻碍代谢物合成中涉及的酶转录或转译、通过钝化代谢物合成中涉及的酶(例如，通过转译后修饰或与不可逆抑制剂结合)或除此之外通过抑制代谢物合成中涉及的酶活性)、通过结合抑制癌症特异性代谢物的功能、通过结合到靶癌症特异性代谢物(例如，竞争性或非竞争性抑制剂)或通过增加代谢物的断裂或廓清率来降低癌症特异性代谢物的水平。化合物可以通过例如，抑制癌症特异性代谢物的断裂或廓清率(例如，通过抑制代谢物断裂中涉及的酶)，通过增加癌症特异性代谢物的前体水平或通过增加代谢物对其目标的亲和力来提高癌症特异性代谢物的水平。典型的治疗靶标包括但不限于甘氨酸-N-甲基转移酶(GNMT)和肌氨酸。代谢途径典型的癌症特异性代谢物的代谢途径描述如下。本发明考虑到其他代谢物用于本发明的组合物和方法，并在如以下实验部分中描述。肌氨酸代谢例如，肝内胆碱代谢中涉及肌氨酸。在哺乳动物的肝内胆碱转化成甘氨酸的氧化降解反应在线粒体中发生，其中其通过特异性转运蛋白进入。此代谢途径中的最后两步由二甲基甘氨酸脱氢酶(Me2GlyDH)催化，该酶将二甲基甘氨酸转化成肌氨酸和肌氨酸脱氢酶(SarDH)，其将肌氨酸(正甲基甘氨酸)转化成甘氨酸。两种酶位于线粒体基质中。因此，在某些实施方案中，治疗组合物靶定Me2GlyDH和/或SarDH。通过使用本文所述的药物筛选方法鉴定典型的化合物。羟基乙酸代谢胆固醇利用的最终产物是在肝内合成的胆汁酸。胆汁酸的合成是排泄多余胆固醇的主要机制。然而，胆固醇以胆汁酸形式排泄不足以补偿胆固醇的过量摄入。在人类胆内最丰富的胆汁酸是鹅胆酸(45% )和胆酸(31% )。在胆汁酸分泌到毛细胆管中之前，其羧基通过酰胺键与甘氨酸或牛磺酸共轭。这种共轭反应分别得到甘氨胆酸和牛磺胆酸。毛细胆管与胆小管结合，然后形成胆管。胆汁酸从肝中通过这些管道运载到胆囊中，在其中储藏胆汁酸以备后用。胆汁酸的最终归宿是分泌到肠中，其中它们辅助对饮食中脂肪乳化。在肠道中，移除甘氨酸和牛磺酸残渣并将胆汁酸排泄(仅有的很小百分比)或通过肠道再吸收返回到肝中。把这个过程称为肠肝循环。辛二酸代谢辛二酸，也称为氨基辛二酸，是具有分子SC6H12(COOH)2的二羧酸。二羧酸的过氧化物酶代谢导致排泄到尿液中的中链二羧酸己二酸、辛二酸和癸二酸的产生。黄苷代谢在嘌呤核苷代谢中涉及黄苷。特别地，黄苷是肌苷转化成鸟苷的中间产物。黄苷 酸能够用于嘌呤代谢中肌苷酸脱氢酶活性的定量测量，推荐使用以确保对罹患急性淋巴细胞白血病的(ALL)的儿童施行最佳的硫唑嘌呤治疗。聚胺代谢聚胺具有两个或多个伯氨基，而且是真核细胞和原核细胞中的基本分子。尽管已知聚胺通过高调节通路在细胞中合成，它们的实际功能并不完全清楚。作为阳离子，它们以定期间隔的时间间隔与DNA结合。如果抑制细胞聚胺合成，细胞生长将停止或严重延缓。外原性聚胺的供应恢复了这些细胞的生长。大多数真核细胞在其细胞膜上具有聚胺转运蛋白系统，能够促进外原性聚胺的内在化。这种系统在快速增殖细胞中具有高活性，并且是某些化学疗法(例如，DMFO, MGBG, BCNU及其类似物)的目标。聚胺还是多种离子通道的重要调制器，包括NMDA受体和AMPA受体。它们阻碍内向整流钾通道，从而保存细胞能量(跨细胞膜的K+离子梯度)。聚胺的实例包括但不限于腐胺、尸胺、精胺和牙精胺。腐胺通过从精氨酸起始的两种不同通路合成。在一个通路中，精氨酸通过酶精氨酸脱羧酶(ADC)催化的反应转化成胍丁胺；然后胍丁胺通过胍丁胺亚胺羟化酶(AIH)转化成氨甲酰腐胺。最终，氨甲酰腐胺转化成腐胺。在第二个通路中，精氨酸转化成鸟氨酸，然后鸟氨酸通过鸟氨酸脱羧酶(ODC)转化成腐胺。使用赖氨酸脱羧酶(LDC)在一步反应中从赖氨酸中合成尸胺。使用来自脱羧S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的氨丙基基团从腐胺合成牙精胺。通过牙精胺合酶催化该反应。在酶精胺合酶存在下使用SAM从牙精胺反应中合成精胺。脂肪酸代谢脂肪酸包含通常具有无支链的脂肪族尾状物(链)的饱和或不饱和的羧酸。脂肪酸的实例包括但不限于肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸(也称为正十二烷酸)和油酸。肉豆蘧酸，也称为十四酸或14:0，是分子式为CH3(CH2)12COOH的常见饱和脂肪酸。肉豆蘧酸盐是肉豆蘧酸的盐或酯。肉豆蘧酸以豆蘧核仁(肉豆蘧)为名。肉豆蘧酯是75%三肉豆蘧酸甘油酯，肉豆蘧酸的甘油三酯。除豆蘧核仁之外，肉豆蘧酸也在棕榈油、椰子油、乳脂和鲸油，即来自抹香鲸油脂的结晶分数。肉豆蘧酸还以协同转译的方式普遍加入到倒数第二个氮末端，受体相关激酶中的甘氨酸中以赋予酶的膜定位。肉豆蘧酸具有充分的高疏水性，能够纳入真核细胞的血浆膜双层磷脂的脂肪酰基核心中。肉豆蘧酸以这种方式充当生物膜中的脂质锚发挥作用。棕榈酸，IUPAC命名中的CH3 (CH2)14COOH或十六酸，是在动植物中最常见的饱和脂肪酸之一，也是来自棕榈树油脂(棕榈油和棕榈仁油)的主要成分。棕榈一词源自法语"棕榈(palmitique)"，即棕榈树的髓。棕榈酸是脂肪生成(脂肪酸合成)过程中产生的第一种脂肪酸，从中能够产生较长的脂肪酸。棕榈酸盐在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)上阴性反�。肁CC负责将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，将其加入到生长酰基链从而阻碍棕榈酸盐的进一步生成。花生四烯酸(也称为AA或ARA)是ω-6脂肪酸20:4 (ω-6)。其对应于花生油中的饱和花生酸(落花生属-花生)。花生四烯酸是具有20个碳链和4个顺式双键的羧酸；第一个双键位于ω端的第6个碳上。“花生四烯酸”偶尔用于指定任何一种二十碳四烯酸。然而，术语普遍限于所有-顺式5、8、11、14_ 二十碳四烯酸。花生四烯酸通过酶磷脂酶Α2 (PLA2)从磷脂分子中释放，其使脂肪酸断裂，但还能够通过DAG脂肪酶从DAG中生成。为了发信号 的目的而生成的花生四烯酸好像是通过磷脂酰胆碱特异性胞浆型磷脂酶Α2 (cPLA2,85kDa)的作用获得，而炎性的花生四烯酸通过低分子量分泌的PLA2 (SPLA2，14-18kDa)的作用生成。花生四烯酸在类二十烷酸产生过程中是前体1)酶环加氧酶和过氧化物酶导致前列腺素H2的产生，其反过来用于产生前列腺素、环前列腺素和凝血烷；2)酶5-脂氧合酶导致5-HPETE的产生，其反过来用于产生白细胞三烯；3)花生四烯酸还用于大麻素的生物合成；和4)某些花生四烯酸通过表氧化酶转化成羟基二十碳四烯酸(HETEs)和环氧二十碳三酸(EETs)。这些衍生物的产生及其在体内的作用统称为花生四烯酸级联。硬脂酸或18:0是饱和脂肪酸。其是具有化学式C18H36O2或CH3(CH2) 16C00H的蜡状固体。硬脂酸经历饱和羧酸的典型反应、向硬脂醇的显著还原和与一系列乙醇产生的酯化反应。在人类体内标记的同位素(Emken等(1994) Am. J. Clin. Nutr. 60 1023S-1328S)表明氧化性去饱和成油酸的膳食硬脂酸部分比类似转化成十六烯酸的棕榈酸部分高2. 4倍。而且，硬脂酸不大可能纳入胆固醇酯中。油酸是在多种动植物源中出现的单不饱和ω-9脂肪酸，而且是人类脂肪组织中具有最高丰度的脂肪酸。其具有分子式CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOH)。油酸的反式异构体称为反油酸。小分子治疗在某些实施方案中使用小分子治疗。在某些实施方案中，小分子治疗靶定癌症特异性代谢物。在某些实施方案中使用如本发明的药物筛选方法来鉴定小分子治疗。基于核酸的治疗在其他的实施方案中使用基于核酸的治疗。典型的基于核酸的治疗包括但不限于反义RNA、siRNA和miRNA。在某些实施方案中，基于核酸的治疗靶定癌症特异性代谢物(如上所述)的代谢途径中的酶表达。在某些实施方案中，基于核酸的治疗是反义的。将SiRNA作为基因特异性治疗剂使用(Tuschl 和 Borkhardt, Molecular Intervent. 2002 ；2(3) :158-67,其内容通过引用纳入本文)。siRNA转染到动物细胞中结果得到有力而长久持续的特异性基因转录后沉默(Caplen 等，Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2001 ；98 :9742-7 ；Elbashir 等 Nature. 2001 ；411 :494-8 ；Elbashir 等 Genes Dev. 2001 ；15 :188-200 ;和 Elbashir 等 EMBO J. 2001 ；20 6877-88，它们的全部内容通过引入纳入本文)。在例如美国专利号6，506, 559中描述了使用siRNA施行RNA干扰的方法和组合物，其内容通过引用纳入本文。在其他的实施方案中，使用反义化合物操纵癌症特异性代谢物的代谢途径中涉及的基因表达，该反义化合物与一种或多种编码酶的核酸特异性杂交(参见例如，GeorgSczakiel, Frontiers in Bioscience 5, dl94_201 January I,2000 ;Yuen 等 Frontiersin Bioscience d588_593, June 1,2000 ；Antisense Therapeutics, Second Edition,Phillips, M. Ian, Humana Press, 2004 ;它们的全部内容通过引用纳入本文)。基因治疗本发明考虑到了用于本文所述的癌症特异性代谢物的代谢途径中涉及的酶表达的任何基因操纵的用途。基因操纵的实例包括但不限于，基因敲除(例如，使用如重组方式从染色体中移除基因)、具有或不具有导入型启动子的反义结构表达，诸如此类。可以使用 任何合适的方法实施核酸结构向体外或体内细胞的递送。合适的方法是将核酸结构引入到细胞中以发生所需事件(例如，反义结构的表达)。基因疗法还可以用于递送siRNA或在体内表达的其他干扰分子(例如，根据导入型启动子的刺激)。通过任何方法完成运载基因信息导入到细胞中的分子中，这些方法包括但不限于裸DNA结构的定向注射、使用所述结构装载的金颗�：浠骱痛蠓肿邮褂美缰侍濉⑸锞酆衔锏鹊鹊鹘诨蜃�。优选的方法使用来源于细菌的基因递送负载体，这种细菌包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。来源于腺病毒的载体由于具有比逆转录病毒更高的效率，成为将核酸分子转移到体内宿主细胞的优选基因递送负载体。已经显示出腺病毒载体能够非常有效地将体内基因转移到动物模型的多种实体瘤中，而且转移到免疫缺陷小鼠的人类实体瘤异种移植中。腺病毒载体的实例和基因转移的方法在PCT公开号 WO 00/12738 和 WO 00/09675 以及美国专利申请号 6，033，908,6, 019，978,6, 001，557、5，994，132,5, 994，128,5, 994，106,5, 981，225,5, 885，808,5, 872，154,5, 830，730 和5，824，544中描述，它们的全部内容通过引用纳入本文。载体可以以多种方式施用于受试者。例如，在本发明的某些实施方案中，使用直接注射的方法向肿瘤或肿瘤相关组织施用载体。在其他的实施方案中，通过血液或淋巴循环进行施用(参见例如，PCT公开号99/02685，它的全部内容通过引用纳入本文)。腺病毒载体的典型剂量水平优选为添加到灌流中的IO8至IO11载体颗粒。抗体治疗在某些实施方案中，本发明提供靶定癌症特异性代谢物或在其代谢途径中涉及的酶的抗体。可以在本文所公开的治疗方法中使用任何合适的抗体(例如，单克隆、多克隆和合成的抗体)。在优选的实施方案中，用于癌症治疗的抗体是人化抗体。人化抗体的方法在本领域众所周知(参见例如，美国专利号6，180，370,5, 585，089,6, 054，297和5，565，332 ；每种内容通过引用纳入本文)。在某些实施方案中，基于治疗的抗体配制成如下所述的药物组合物。在优选的实施方案中，施用本发明的抗体组合物会得到可预见地降低癌症的效果(例如，减少或根除肿瘤)。
药物组合物本发明进一步提供药物组合物(例如，包含调节癌症特异性代谢物的水平或活性的药剂。本发明的某些实施方案中的药物组合物可以以很多方式施用，其取决于是否需要局部或全身治疗和治疗部位。施用可以是局部的(包括眼的和包括鞘内的以及直肠递送到粘膜)、肺的(例如，通过粉末或气溶胶吸入或吹入，包括通过喷雾剂；通过气管内的、鼻内的、表皮的和经皮的)、口服或肠胃外的方式。肠胃外施用包括静脉、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或注入；或颅内的，例如，鞘内或心室内施用。局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、膏状物、凝胶、滴齐IJ、栓剂、喷雾、液体和粉末。常规药物载体、水性、粉末或油性基、增稠剂等等是必要或理想的。
口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小袋或片剂。增稠剂、矫臭剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂是理想的。肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于穿透增强剂、载体化合物和其他药理上接受的载体或赋形剂。本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从多种成分中生成，这些成分包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。可以以单位剂量形式便宜存在的本发明的药物制剂可以根据工业制药领域众所周知的常规技术来制备。这种技术包括使用药物载体或赋形剂建立活性成分缔合的步骤。一般地，通过使用液体载体或细分的固体载体或两者都有来统一而密切地建立活性成分的缔合，然后如有必要，使产物成型来制备制剂。本发明的组合物可以配制成任何可能的剂量形式，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制成水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加悬浮液粘性的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以配制成并用作泡沫。药物泡沫包括制剂，例如但不限于乳剂、微型乳剂、膏状物、凝胶剂和脂质体。虽然这些制剂的性质基本相似，但它们在成分和最终产物的稠度方面不同。在细胞水平上增强寡核苷酸摄取的试剂还可以加入到本发明的药物和其他组合物中。例如，阳离子脂质体，诸如脂质转染(美国专利号5，705，188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，诸如聚赖氨酸(W097/30731)，也增强细胞的寡核苷酸的摄取。发明的组合物可以另外含有在药物组合物中常见的其他辅助成分。因此，例如，组合物可以含有其他的、配伍的、具有药理活性的材料，例如，止痒药、止血剂、局部麻醉剂或消炎剂，或者可以含有能够实际配制成本发明组合物的多种剂量形式的其他材料，诸如染色剂、矫臭剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂、和稳定剂。然而，当加入这些材料时，它们不应过度干扰本发明组合物成分的生物活性。如有需要，制剂可以进行无菌处理，并与辅助试剂混合，这些辅助试剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等不会与制剂的核酸相互作用产生有害物质的试剂。
本发明的指定实施方案提供了药物组合物，含有(a) —种或多种核酸化合物和(b) 一种或多种以不同机制发挥功能的其他化疗剂。这种化疗剂的实例包括但不限于抗癌药，诸如柔红霉素、放线菌素D、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、长春新碱、长春花碱、表鬼白毒、表鬼白毒噻吩糖苷、顺氯氨钼和已烯雌酚(DES)。抗炎药包括但不限于非类固醇抗炎药和皮质类固醇，而且抗病毒药物包括但不限于病毒唑、阿糖腺苷、无环鸟苷和9-(1，3_ 二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤，还可以与本发明的组合物结合。其他非反义化疗剂也在本发明范围内。两个或多个结合的化合物可以同时或顺序使用。定量取决于待治疗病状的严重程度和应答性，疗程持续几天至几个月，或直到出现治疗效果或病状减轻的情况。能够通过测量患者体内的药物累积量来计算最佳定量安排。施用医生能够轻易确定最佳的剂量、定量方法和重复率。最佳剂量可以随单个寡核苷酸的相对效率而变化，而且一般可以基于在动物模型的体外或体内有效用的EC5tl或基于本文所述的实例来估计。一般地，剂量是每公斤体重的O. 01 μ g至100g，而且可以每天、每周、 每月以及每年给药一次或多次。治疗医生能够基于测量的停留时间和体液或组织中的药物浓度来估计定量的重复率。成功治疗后，理想的情况是使受试者接受维持治疗以避免病状复发，其中以每公斤体重的O. 01 μ g至IOOg维持剂量施用药物组合物，每天一次或多次至每20年一次。药物筛选应用在某些实施方案中，本发明提供药物筛选测定(例如，针对抗癌药进行筛选)。本发明的筛选方法使用本文所述的癌症特异性代谢物。如上所述，在某些实施方案中，测试化合物是小分子、核酸或抗体。在某些实施方案中，测试化合物直接靶定癌症特异性代谢物。在其他的实施方案中，它们靶定癌症特异性代谢物的代谢途径中涉及的酶。在优选的实施方案中，药物筛选方法是高流通量药物筛选方法。高流通量筛选的方法在本领域内众所周知，而且包括但不限于那些在美国6468736、W006009903和5972639文献中所描述的方法，它们的全部内容通过引用纳入本文。通过使用本领域已知的任何一种组合库方法的许多途径得到本发明的某些实施方案的测试化合物，这种组合库包括生物库；类肽库(具有肽的功能，但具有新颖的非肽主链的分子库，其对酶降解耐受但仍然保持生物活性；参见例如，Zuckennann等J. Med.Chem. 37 =2678-85[1994]);空间可编址的并行固态相或液态相库；需要退褶合的合成库方法；“一珠一化合物”库方法；和使用亲和性色谱法选择的合成库方法。生物库和类肽库途径优选地用于肽库，而其他四种途径可用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子库(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145)。分子库合成方法的实例可以在本领域中，例如在=DeWitt等Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 90 :6909 [1993] ；Erb 等 Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91 :11422 [1994]；Zuckermann 等 J. Med. Chem. 37 2678[1994] ；Cho 等 Science 261 1303[1993] ；Carre11等 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33. 2059 [1994] ；Carell 等 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 2061 [1994];和 Gallop 等 J. Med. Chem. 37 :1233 [1994]发现。化合物库可以存在于溶液(例如，Houghten,Biotechniques 13 :412_421 [1992])或珠(Lam, Nature 354 :82-84[1991])、片(Fodor, Nature 364 :555-556[1993])、细菌或孢子(美国专利号5，223，409，其内容通过引用纳入本文)、质粒(Cull等Proc.Nad. Acad. Sci. USA 89 18651869[1992])或噬菌体(Scott 和 Smith，Science 249 386-390 [1990] ；Devlin Science 249 :404-406 [1990] ；Cwirla 等 Proc. Natl. Acad.Sci. 87 :6378-6382[1990] ;Felici，J. Mol. Biol. 222 :301 [1991])中。在某些实施方案中，本文所述的标志物用于产生鉴别癌症治疗剂的模型系统。例如，癌症特异性生物标志物的代谢物(例如，活化细胞增殖的肌氨酸)能够加入到细胞系中增强细胞系的癌症侵入性。细胞系会具有改善的用于抗癌剂筛选的应答(例如，‘读出’)动态范围。当描述体外实例时，模型测定系统可以是在体外、体内或来自体内的。转基因动物本发明考虑到包含外源基因(例如，从改变的癌症特异性代谢物水平得到的)的转基因动物的生成。在优选的实施方案中，与野生型动物相比，转基因动物显示出改变的表 型(例如，代谢物的增加或减少)。分析这种表型的存在或缺失的方法包括但不限于那些在本文中公开的内容。在某些优选的实施方案中，转基因动物还显示出增加或减少的肿瘤生长或癌症迹象的发展。本发明的转基因动物用于药物(例如，癌症治疗药物)筛选。在某些实施方案中，将测试化合物(例如，疑似用于治疗癌症的药物)和对照化合物(例如，安慰剂)施用于转基因动物和对照动物，并评估它们的效果。转基因动物能够通过多种方法生成。在某些实施方案中，将不同发育阶段的胚胎细胞用于导入转基因动物产生的转基因。根据胚胎细胞的发育阶段使用不同方法。受精卵是微量注射的最佳靶。在小鼠体内，雄性核的直径达到大概20微米的尺寸，允许1-2皮升(pi) DNA溶液的可重复注射。将受精卵做为基因转移靶使用的主要优势在于，在大多数情况下，注射的DNA在第一次裂解前会纳入到宿主基因组内(Brinster等Proc. Natl. Acad. Sci.USA82 :4438-4442[1985])。结果，转基因非人类动物的所有细胞将携带纳入的转基因。一般地，这还会通过转基因的有效传输反射到创立者的后代中，因为50%的生殖细胞将存有转基因。美国专利号4，873，191描述了微量注射受精卵的方法。该专利公开的全部内容纳入本文。在其他的实施方案中，使用逆转录病毒感染将转基因导入如非人类动物中。在某些实施方案中，通过将逆转录病毒载体注射到卵母细胞的卵周隙内来使用逆转录病毒载体转染卵母细胞(美国专利号6，080，912，其内容通过引用纳入本文)。在其他的实施方案中，发育中的非人类胚胎能够在体外培养成胚泡阶段。在此时期中，卵裂球成为逆转录病毒感染的目标(Janenich,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 :1260 [1976])。通过酶处理得到卵裂球的有效感染以移除透明带(Hogan 等 in Manipulating the Mouse Embryo, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1986])。用于导入转基因的病毒载体系统是典型的携带转基因的复制缺陷逆转录病毒(Jahner等Proc. Natl. Acad Sci.USA 82 :6927[1985])。通过在产生病毒细胞的单层上培养卵裂球轻易且有效地获得转染(Stewart，等EMBO J.，6 :383[1987])。可选地，在后期施行感染。病毒或产生病毒的细胞能够注射到胚泡腔内(Jahner等Nature 298 :623 [1982])。大多数创立者会成为转基因的嵌合体，因为纳入只在形成转基因动物的细胞子集内产生。此外，创立者可以在基因组的不同位置含有转基因的多种逆转录病毒嵌入，其一般会在后代中分离。另外，还可能通过妊娠中期胚胎的子宫内逆转录病毒感染将转基因导入入种系中，尽管这是低效率的(Jahner等，如上所述[1982])。本领域已知的使用逆转录病毒或逆转录病毒载体产生转基因动物的其他方法包含逆转录病毒粒子或丝裂霉素C处理细胞(产生逆转录病毒进入受精卵或早期胚胎)的微量注射(PCT 国际申请 W090/08832[1990]，和 Haskell 和 Bowen，Mol. Reprod.Dev. ,40 :386[1995])。在其他的实施方案中，将转基因导入入胚胎干细胞内，并使用转染的干细胞形成胚胎。通过在适当的条件下体外培养植入前胚胎获得ES细胞(Evans等Nature 292 154 [1981] ；Bradley 等 Nature 309 :255 [1984] ；Gossler 等 Proc. Acad. Sci. USA 83:9065[1986];和Robertson等Nature 322 :445[1986])。通过本领域已知的多种方法进行DNA转染使得转基因能够有效导入ES细胞中，这些方法包括磷酸钙共同沉淀、原生质体或原生质球融合、脂质转染和DEAE-葡聚糖介导转染。还可以通过逆转录病毒介导转导或通过微量注射将转基因导入ES细胞中。这种转染的ES细胞在其导入到胚泡阶段胚胎的囊胚腔内以后能够殖民胚胎，并有助于得到的嵌合体动物的种系(参考参见Jaenisch, Science240 :1468 [1988])。在将转染的ES细胞导入到囊胚腔之前，转染的ES细胞可以在多种选择协议下补养ES细胞，假定转基因提供了这种选择的方式，这种ES细胞已经合并了转基因。 可选地，可以使用聚合酶链反应筛选已经合并转基因的ES细胞。这种技术消除了在转染的ES细胞转移入囊胚腔前在适当的选择条件下生长的需求。在还其他的实施方案中，使用同源重组敲除基因功能或产生缺失突变体(例如，截断突变体)。同源重组的方法在美国专利号5，614，396中描述，其内容通过引用纳入本文。
具体实施例方式提供以下实施例以说明并进一步阐述指定优选的实施方案和本发明的方面，并不旨在限制本发明的范围。实施例I尿液中发现的生物标志物一般方法对前列腺癌的代谢特征的鉴定分析每个样本以确定几百种代谢物的浓度。实用分析技术诸如GC_MS(气相色谱-质谱测定法)和UHPLC-MS (超高效液相色谱-质谱测定法)来分析代谢物。同时并联分析多种等份并在适当的质量管理(QC)后，重组从每个分析中得到的信息。根据最终归结为几百种化学物种的几千种特性给予每个样本特征。使用的技术能够鉴定新的化学上未命名的化合物。统计分析使用t检验分析数据以鉴定分子(已知命名的代谢物或未命名的代谢物)，其以不同水平存在于可限定的群体或亚群体(例如，与对照生物学样本相比，前列腺癌生物学样本的生物标志物)中，用于区别可限定群体(例如，前列腺癌和对照，低级前列腺癌和高级前列腺癌)。也鉴定在可限定群体或亚群体中的其他分子(已知命名的代谢物或未命名的代谢物)。在某些分析中，根据样本中的肌酐水平标准化数据，而在其他分析中未标准化样本。两种分析的结果都包括在内。生物标志物的鉴定在分析(例如GC-MS、UHPLC-MS、MS_MS)中鉴定的不同峰值包括那些鉴定为统计性显著的峰值进行以化学鉴定过程为基础的质谱测定法。通过(I)分析来自不同组人类受试者的尿液样本以确定样本中代谢物的水平，然后(2)统计性分析结果以确定在两组中差别存在的那些代谢物来发现生物标志物。区分癌症和非癌症的生物标志物用于分析的尿液样本来自51个具有前列腺癌阴性活检的对照个体和59个罹患前 列腺癌的个体。在确定代谢物的水平后，使用Wilcoxon检验分析数据以确定在两个群体(例如，前列腺癌vs.对照)中代谢物平均水平的不同。如下表I所列出的，发现了从罹患前列腺癌的受试者和具有前列腺活检(例如，未诊断出前列腺癌)的受试者中取得的血浆样本中差别存在的生物标志物。针对每个列出的生物标志物，表I包括在与生物标志物相关数据的统计分析中确定的P值、用于追踪化学数据库和分析平台中的化合物的化合物ID，其用于鉴别化合物(GC是指GC/MS，而且LC是指UHPLC/MS/MS2)。以O. 000列出的P值在p < O. 0001处是显著的。LC阳和LC阴是指使用缓冲液和分别检测阳性离子或阴性离子的优化的参数的UHPLC离析。表I.用于区别癌症和非癌症的生物标志物。
权利要求
1.一种诊断前列腺癌的方法，包括 a)检测受试者的尿液样本中肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平；和 b)当肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水平比非癌症受试者中的水平更高时，诊断前列腺癌。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法进一步包括检测一种或多种代谢物水平的步骤，所述代谢物选自由乙酰氨基葡糖、犬尿胺酸、尿嘧啶、高半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、牙精胺、精胺、2-氨基己二酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、马来酸盐、组氨酸、瓜氨酸、腺苷和肌苷组成的组中。
3.—种诊断乳腺癌的方法，包括 a)检测受试者样本中一种或多种癌症特异性代谢物的存在或缺失，所述癌症特异性代谢物选自由哌可酸、丝氨酸、聚胺和脂肪酸组成的组；和 b)基于所述一种或多种癌症特异性代谢物的存在或缺失诊断乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚胺选自由腐胺、牙精胺和精胺组成的组中。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述脂肪酸选自由肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸组成的组中。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述样本选自由组织样本、血液样本、血清样本和尿液样本组成的组中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组织样本是活检样本。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种癌症特异性代谢物存在于癌症样本中，但不存在于非癌症样本中。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种癌症特异性代谢物不存于癌症样本中，但存在于非癌症样本中。
10.根据权利要求3所述的方法，包括同时检测一种以上所述癌症特异性代谢物的存在或缺失。
11.一种断前列腺癌的方法，包括 a)检测受试者尿液样本中一种或多种癌症特异性代谢物的存在或缺失，所述癌症特异性代谢物选自由哌可酸、丝氨酸、聚胺和脂肪酸组成的组；和 b)基于在所述尿液样本中的所述癌症特异性代谢物的存在或缺失诊断前列腺癌。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚胺选自由腐胺、牙精胺和精胺组成的组。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂肪酸选自由肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸、硬脂酸、月桂酸和油酸。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述尿液样本是尿沉渣样本。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种癌症特异性代谢物存在于癌症样本中，但不存在于非癌症样本。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种癌症特异性代谢物不存在于癌症样本中，但存在于非癌症样本中。
17.根据权利要求11所述的方法，包括一种以上所述癌症特异性代谢物的存在或缺失的同 时检测。
全文摘要
本发明涉及癌症标志物。特别地，本发明提供在癌症(例如，前列腺癌或乳腺癌)中差别存在的代谢物和代谢物组。
文档编号G01N33/68GK102893157SQ201080064533
公开日2013年1月23日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者A.M.钱奈延, T.拉詹迪兰 申请人:密执安大学评议会
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