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专利名称：一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒。
背景技术：
α1-酸性糖蛋白，分子量约40000，是一种非特异性急性时相反应蛋白，也是人类血清中含糖量最多(含糖约45%)、酸性最强(PI为2.7 3.5)的糖蛋白。α1-酸性糖蛋白主要由肝脏巨噬细胞和粒细胞产生，癌细胞也可合成。α1-酸性糖蛋白是目前较为敏感的急性期反应的炎症标志物，是急性时相反应物之一。其对炎症、感染反应早于体温及白细胞数的变化，故广泛用于临床:(1) α -酸性糖蛋白含量升高:病理情况下，白介素I刺激吞噬细胞释放出脂多聚糖，可促进α1-酸性糖蛋白的合成使血中水平升高，故α1-酸性糖蛋白是一种最稳定的早期呈阳性的急性时相反应物。如感染(炎症)、外伤、烧伤、手术、急性心肌梗死时α1-酸性糖蛋白含量升高。另外类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、克隆病、恶性肿瘤也增高，在癌转移时升高更明显。(2)α1-酸性糖蛋白浓度降低:肝细胞病变晚期、肾病综合症或其他原因所致尿中滤过的蛋白质量丢失、遗传因素和营养不良等疾病。现有技术中常用的α1-酸性糖蛋白检测方法是放射免疫分析法、酶联免疫法。这些技术存在诸多不足，如需要特殊的设备，样本需要预处理，不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫法应用比较普遍，但该方法为非均相免疫检测系统，测定过程较为繁琐，耗时长，缺少单位测试运行时间；自动化程度不高，批间差和 重复性相对较大；需要配备多种专门设备，一定程度上增加了成本。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其操作简单、重复性好、可进行批量样本全自动化检测，从而消除上述背景技术中缺陷。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中:试剂Rl包含缓冲液10 500mM、表面活性剂0.5 50g/L、电解质5 50g/L、高分子促进剂2 100g/L、稳定剂5 50g/L、防腐剂I 10g/L ；试剂R2包含缓冲液10 500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗体15% 30% (w/v)、电解质5 50g/L、防腐剂I 10g/L ；校准品包含缓冲液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、稳定剂5 50g/L、防腐剂I 10g/L、抗氧化剂0.01 10g/Lo
上述缓冲液10 500mM，也就是浓度为10 500mmo 1/L。抗人α1-酸性糖蛋白抗体15% 30% (w/v),也就是浓度为150 300g/L。其中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、TRIS缓冲液、CAPS0、M0PS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液中的一种或几种；缓冲液的pH范围是5.5 9.0 ;所述表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚一种或几种；所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁一种或几种；所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠中的一种或几种；所述稳定剂选自甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或几种；所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述抗人α1-酸性糖蛋白抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人α1-酸性糖蛋白抗体中的一种或两种；所述抗人α1-酸性糖蛋白抗体种类包括单克隆抗体和多克隆抗体；所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、没食子酸丙酯、特丁基对苯二酚、维生素系列中的一种或几种。为了保证试剂R1、试剂R2的缓冲体系一致，作为优选的技术方案，所述试剂Rl和试剂R2的缓冲液种类相同。作为一种优选的技术方案，所述试剂盒中，试剂Rl 包含 pH 为 7.0 8.0 的 TRIS 缓冲液 10 50mM、Tween200.5 5g/L、氯化钠5 15g/L、乙二醇聚氧乙烯醚50 100g/L、乙二胺四乙酸二钠5 10g/L、叠氮钠I 5g/L ；试剂R2包括包含pH为7.0 8.0的TRIS缓冲液10 50mM、羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗体15% 30% (w/v)、电解质5 50g/L、防腐剂I 10g/L ；校准品包括TRIS缓冲液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原0.05 5.0g/L、乙二胺四乙酸二钠5 50g/L、叠氮钠I 10g/L、丁基轻基茴香醚0.01 10g/L。上述羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗体15% 30%(w/v)，也就是羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗体的浓度为150 300g/L。其中，所述校准品中，α1-酸性糖蛋白抗原浓度优选0.1 3.0g/L。所述校准品可以制备成高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本发明的免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，其基本原理是:样本中的α1-酸性糖蛋白抗原和试剂R2中的α1-酸性糖蛋白抗体发生相应的抗原抗体反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，使反应液产生一定的浊度。反应液中α1-酸性糖蛋白抗体过量时，形成的免疫复合物的量随着样本中α1-酸性糖蛋白抗原量的增加而增加，反应液的浊度也相应增加。在特定波长下测定该复合物的吸光值，与校准品标定的校准曲线比较，即可计算出样本中的α1-酸性糖蛋白的含量。由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:本发明检测试剂，使用操作简单，可以应用于多种机型的全自动生化分析仪和半自动生化分析仪，能够满足临床快速、高通量检测样本的要求；重复性实验表明试剂盒具有高精密度、准确度高的特点；与进口试剂对比实验表明本发明试剂盒相关性好，线性好，重复性高；试剂盒由于使用了筛选的最优化试剂组合，使得试剂的稳定性大大提高，2-8° C可以稳定存放一年以上。因此本发明试剂盒具有很高的临床应用价值。


图1为本发明实施例4检测α 1_酸性糖蛋白含量的方法流程示意图；图2为本发明实施例4的α1-酸性糖蛋白校准品的标准曲线图；图3为本发明实施例6的本发明试剂和进口对比试剂的相关性曲线图。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例11.配制试剂:
试剂Rl:TRIS (缓冲液)IOOmMTween 20 (表面活性剂)2 g/L氯化钠(电解质)8.5 g/L乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂) 40 g/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)7 g/L叠氮钠(防腐剂)3 g/LpH 值7.5试剂R2:
羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗体20% ( w/v ) TRIS (缓冲液)40 mM 氯化钠(电解质)B.5 g/L叠氮钠(防腐剂)7 g/L pH 值8.0校准品:
CAPSO (缓冲液)50mM乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)7g/L叠氮钠(防腐剂)6g/L丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)0.6 g/L按照需要的校准品浓度将相应量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制备得到α1-酸性糖蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例配制6个不同浓度的参考校准品，分别为0g/L、0.15g/L、0.31g/L、0.62g/L、l.24g/L、
2.50g/L。然后用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。实施例21.配制试剂:试剂Rl:
石粦酸盐(缓冲液)10 mM 聚氧乙烯壬基苯基醚(表面活性剂)0.5 g/L 氯化钾(电解质)5 g/L 脂脒醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂)2 g/L 牛血清蛋白(稳定剂)5 g/L 叠氮钠(防腐剂)I g/L pH 值9.0试剂R2:
兔抗人α -酸性糖蛋白单克隆抗体15% (w/v ) 磷酸盐(缓冲液)500 mM 氯化钠(电解质)50 g/L 叠氮钠(防腐剂)10 g/L pH 值6.0 校准品:TRIS (缓冲液)200 mM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)50 g/L
对羟基苯甲酸(防腐剂)10 g/L
二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)O 01 g/L
od-酸性糖蛋白抗原2.7 g/L按照需要的校准品浓度将相应量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制备得到α1-酸性糖蛋白校准品。本实施例选用的是高浓度单点参考校准品，α1-酸性糖蛋白抗原浓度为2.7g/L，然后用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，其中一个未添加α1-酸性糖蛋白抗原，作为空白试剂，α1-酸性糖蛋白抗原浓度分别为 0g/L、0.17g/L、0.34g/L、0.68g/L、l.35g/L、2.70g/L0实施例31.配制试剂:试剂Rl:
TRIS (缓冲液)500 mM
Tween 20 (表面 活性剂)40 g/L
氯化钠(电解质)20 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂) 10 g/L 乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)30 g/L
叠氮钠(防腐剂)2 g/L
pH 值5.5试剂R2:
羊抗人Cd-酸性糖蛋白多克隆抗体30% ( w/v )
TRIS (缓冲液)10 mM
氯化钠(电解质)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)10 g/L
pH 值8.5校准品:CAPSO (缓冲液)200 mM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)8 g/L按照需要的校准品浓度将相应量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制备得到α1-酸性糖蛋白校准品。本实施例配制6个不同浓度的参考校准品，分别为Og/L、
0.15g/L、0.31g/L、0.62g/L、l.24g/L、2.50g/L。然后用 0.22 μ m 的滤膜过滤除菌，放置 2 8°C保存。实施例41.配制试剂:试剂Rl:
TRIS (缓冲液)50 mM
Tween 20 (表面活性剂)I g/L 氯化钠(电解质)8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂)60 g/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
pH 值8.0试剂R2:
羊抗人α -酸性糖蛋白多克隆抗体15% ( w/v )
TRIS (缓冲液)20 _
氯化钠(电解质)8.5 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
pH 值7.5校准品:
TRIS (缓冲液)40 mM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)6 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)0.2 g/L
α -酸性糖蛋白抗原2.7 g/L
按照需要的校准品浓度将相应量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制备得到α1-酸性糖蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例选用的是高浓度单点参考校准品，α1-酸性糖蛋白抗原浓度为2.7g/L，然后用0.22μπι的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，其中一个未添加α1-酸性糖蛋白抗原，作为空白试剂，α1-酸性糖蛋白抗原浓度分别为 Og/L,0.17g/L、0.34g/L、0.68g/L、l.35g/L、2.70g/L。2.检测:a1-酸性糖蛋白检测方法如图1所示，分析方法为两点终点法，具体来说:样本加样量为12 μ 1，试剂Rl和R2加样量分别为225 μ I和75 μ I ；225 μ I试剂Rl加入12 μ I样本在37°C保温5分钟，记录吸光度值ODl后，加入75 μ I试剂R2，37°C继续保温5分钟后记录吸光度值0D2 ;检测波长分别为:主波长340nm，副波长660nm。3.标准曲线绘制:采用本实施例试剂及上述测定方法，使用日立7080全自动生化分析仪测得的6个不同浓度a1-酸性糖蛋白标准品的标准曲线，如图2所示。X轴代表a1-酸性糖蛋白含量，Y轴代表吸光度值。该标准曲线可以用于检测标本a1-酸性糖蛋白含量。实施例5采用实施例4的检测方法及标准曲线，随机取一临床血清样本，使用日立7080全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表I所示。表I检测样本a1-酸性糖蛋白浓度(10次)及变异系数
浓度~~I~ 2 ~3~ 4 ~5~~6~~~8~~9~I 10 I CV (g/L) I 31 1.3 I 29 I j1 I 3j I 31 I 27 1.32 I 29 I 31 L26%结果显示，变异系数为1.26%，同时，采用实施例1-3所述试剂盒检测结果的变异系数小于5%，表明本发明所述试剂盒具有较高精密度。实施例6分别使用本发明试剂和进口对比试剂(罗氏试剂)，使用日立7080全自动生化分析仪对50份临床标本按各自参数同时进行测定，对测定值进行线性回归。本发明试剂参数见实施例4。线性回归得到的回归方程为Y=1.0106X-0.05118，相关系数R2=0.9924，如图3所示。其中X为本发明试剂，Y为对比试剂。结果表明本发明试剂与对比试剂相关性很好，说明本发明试剂具有很好的特异性和准确度。本发明试剂可以适用于日立、奥林巴斯、贝克曼、
雅培等系列的全自动和半自动生化分析仪，分析方法和参数可以根据不同机型进行适当调
M
iF.0本发明不局限于上述具体实施方式
，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。
权利要求
1.一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述试 剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中: 试剂Rl包含缓冲液10 500mM、表面活性剂0.5 50g/L、电解质5 50g/L、高分子促进剂2 100g/L、稳定剂5 50g/L、防腐剂1 10g/L ； 试剂R2包含缓冲液10 500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗体150 300g/L、电解质5 50g/L、防腐剂 1 10g/L ； 校准品包含缓冲液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、稳定剂5 50g/L、防腐剂I 10g/L、抗氧化剂 0.01 10g/L。
2.如权利要求1所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、TRIS缓冲液、CAPSO、MOPS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液中的一种或几种； 所述表面活性剂选自Tr iton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚一种或几种； 所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁一种或几种； 所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠中的一种或几种； 所述稳定剂选自甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或几种； 所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种； 所述抗人α1-酸性糖蛋白抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人α1-酸性糖蛋白抗体中的一种或两种； 所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、没食子酸丙酯、特丁基对苯二酚、维生素系列中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述抗人α1-酸性糖蛋白抗体种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
4.如权利要求2所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述缓冲液的pH范围是5.5 9.0。
5.如权利要求1 4任一项所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述试剂Rl和试剂R2的缓冲液种类相同。
6.如权利要求5所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中， 试剂Rl包含pH为7.0 8.0的TRIS缓冲液10 50mM、Tween200.5 5g/L、氯化钠5 15g/L、乙二醇聚氧乙烯醚50 100g/L、乙二胺四乙酸二钠5 10g/L、叠氮钠I 5g/L ； 试剂R2包括包含pH为7.0 8.0的TRIS缓冲液10 50mM、羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗体150 300g/L、电解质5 50g/L、防腐剂I 10g/L ;校准品包括TRI S缓冲液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原0.05 5.0g/L、乙二胺四乙酸二钠5 50g/L、叠氮钠I 10g/L、丁基轻基茴香醚0.01 10g/Lo
7.如权利要求6所述的一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其特征在于:所述校准品中，α1-酸性糖蛋 白抗原浓度为0.1 3.0g/L。
全文摘要
一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，其试剂R1包含缓冲液10～500mM、表面活性剂0.5～50g/L、电解质5～50g/L、高分子促进剂2～100g/L、稳定剂5～50g/L、防腐剂1～10g/L；试剂R2包含缓冲液10～500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗体150～300g/L、电解质5～50g/L、防腐剂1～10g/L；校准品包含缓冲液10～500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、稳定剂5～50g/L、防腐剂1～10g/L、抗氧化剂0.01～10g/L。本发明使用简便快速，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高，试剂稳定，适合临床推广。
文档编号G01N21/31GK103076456SQ201210576629
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者宿明明, 王庆国, 王爱龙 申请人:潍坊三维生物工程集团有限公司