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专利名称：一种检测乳腺癌her2基因表达量的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种用于检测乳腺癌HER2基因表达量的方法及其试剂盒。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，是威胁女性健康的“头号杀手”。随着人们生活方式的改变，乳腺癌的发病率也呈逐年递增之势。每年全球约有140万女性罹患乳腺癌，更有40万女性死于乳腺癌。根据美国癌症协会2012发布的美国癌症统计预期数据来看，乳腺癌高居女性恶性肿瘤发病率第一位，占所有新发女性恶性肿瘤的29%。在我国，近年来乳腺癌发病率也呈逐年递增的趋势。从1982年到2001年，女性乳腺癌发病率增加了 91%。近期北京、上海、天津等大城市的统计数据显示，乳腺癌已成为我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，每年新增打3% -4%，超过世界水平1-2%，每年有20余万妇女患乳腺癌，发病率为女性易患肿瘤第一位。目前，乳腺癌的预警和早期诊断技术主要有以下几种第一种为定期接受临床体格检查，但是乳腺癌的普查耗资较大，成本高，在我国乳腺癌的早期发现主要着眼于自我检查，当患者发现肿块而就诊时，常常为时已晚；第二种为影像学诊断法，以钥靶X射线摄片为主要手段，以超声波扫描和MRI扫描为辅助，一般可检测表现为肿瘤病变的微小钙化，但是对于不典型的病变，如致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易发生漏诊，且对检测仪器的要求高，耗时，费用高；第三种为生物靶标早期检测，如乳腺癌相关基因的突变分析，血清中肿瘤标志物的测定，由于基因的突变或异常表达通常早于病变的发生，可实现早期预警，且检测方法简单，快速，价格较低。因此，发展生物靶标检测，寻找新的乳腺癌检测靶标作为临床检测且简单实用的技术对于乳腺癌患者提前预警及采用有效的治疗手段意义重大。HER2基因(人表皮生长因子受体2基因)又称neu或c_rbB_2基因，是一种原癌基因，位于17号染色体长臂上，编码185KD跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性，属于人类表皮生长因子受体(EGFR)家族。研究表明，HER2在20% -30%的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达。乳腺肿瘤患者J1ER2阳性意味着乳腺肿瘤细胞表面的HER2蛋白数量增多，过度传递信号，刺激癌细胞疯狂增殖。J1ER2阳性的患者同其他乳腺癌病人相t匕，肿瘤恶性程度更高，进展更快，更容易复发和远处转移，且此类病人通常对内分泌治疗不敏感，预后较差。因此，精确检测HER2的表达对于乳腺癌的早期诊断、预后及个性化治疗等方面具有重要的意义。量子点(Quantum dots, DQs)是一类大小在l-lOnm,半径小于或接近于激子玻尔半径的新型半导体纳米晶体，作为一种应用于生物医学领域的新型纳米荧光材料探针，能克服传统有机荧光染料的不足，具有激发光谱窄、连续，检测灵敏度高，抗漂白能力强，荧光强度高而稳定，生物相容性好，不易受组织自发荧光干扰等优点。现有技术中采用的量子点检测方法一般为用量子点直接与抗体结合制作成探针，实现多抗原同时标记，此方法成本较高，探针保存时间短，需对量子点进行标记，不适合常规临床检测。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测乳腺癌HER2基因表达量的方法及其试剂盒，实现对HER2基因表达量经济、快速、灵敏的检测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，所述的试剂盒中包括(I)抗体稀释缓冲液；(2)孵育缓冲液；(3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液； (4)无镉量子点的水溶液；所述的抗体稀释缓冲液为磷酸与NaCl混合配置的磷酸-NaCl缓冲液；所述的孵育缓冲液为磷酸、NaCl和胎牛血清混合配置的磷酸-NaCl-胎牛血清溶液。优选地，所述的无镉量子点为ZnSe/ZnS核/壳量子点，激发波长为365nm。优选地，所述的抗体稀释缓冲液中磷酸与NaCl的摩尔比为I : I。优选地，所述的抗体稀释缓冲液中磷酸与NaCl的浓度相同，且为0. 0. 1-0. 03mol/L0优选地，所述的孵育缓冲液含有5% -20%的胎牛血清。优选地，所述的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液浓度为I X IO-6Hiol/L-2Xl(T6mol/L。本发明还提供了一种用所述的试剂盒检测乳腺癌HER2基因表达量方法，具体步骤如下(I)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液；(2)将待测细胞加入步骤(I)得到的溶液中，再加入孵育缓冲液，室温条件下联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与待测细胞表面的HER2基因表达蛋白发生特异性的结合反应，将特异性结合反应完毕的溶液低速离心，离心后收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液加入无镉量子点的水溶液中，在365nm下观察无镉量子点荧光，并用荧光光谱仪测定无镉量子点荧光强度或在620-650nm下观察联吡啶钌荧光，并用荧光光谱仪测定联吡啶钌荧光强度。优选地，所述的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与所述的无镉量子点摩尔比为I 20-1 7.5。优选地，步骤⑵中特异性的结合反应的时间为30_60min。优选地，步骤(2)中低速离心的离心力为500_800g。本发明的有益效果在于，第一，本发明中使用的量子点为无镉量子点，减少了对环境的污染；第二，本发明无需对量子点进行修饰，简化了操作步骤；第三，本发明的检测方法及试剂盒实现了对乳腺癌HER2基因表达量的检测，灵敏度好，精确度高。


图I是乳腺癌HER2基因表达量检测方法流程图。图2是实施例I中HER2基因表达量无镉量子点荧光图。图3是实施例2中HER2基因表达量联吡啶钌荧光图。图4是实施例3中HER2基因表达量无镉量子点荧光图。图5是实施例3中HER2基因表达量无镉量子点荧光强度变化图。图6是实施例3中细胞数量与无镉量子点荧光强度线性图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明提供的乳腺癌HER2基因表达量检测方法步骤如下，流程图见图I :(I)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液；(2)将待测细胞和孵育缓冲液加入到(I)所得溶液，联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与待测细胞表面的J1ER2基因表达蛋白发生特异性的结合反应，将特异性结合反应完毕的溶液低速离心，离心后收集上清液；形成抗原抗体结合物，HER基因表达蛋白位于细胞表面，抗体被结合到了细胞表面，结合了抗体的细胞的粒径和质量均比HER2单克隆抗体大，用离心的方法可将二者分离，低速离心时，结合了抗体的细胞会形成沉淀，没有与HER2基因表达蛋白结合的单克隆抗体不会沉淀；(3)将(2)所得上清液加入无镉量子点的水溶液中，在365nm下观察无镉量子点荧光，并用荧光光谱仪测定无镉量子点荧光强度或在620-650nm下观察联吡啶钌荧光，并用荧光光谱仪测定联吡啶钌荧光强度；联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与无镉量子点共同存在时，由于无镉量子点与联吡啶钌之间发生光诱导电子转移，无镉量子点与联吡啶钌形成络合物，形成络合物的无镉量子点的荧光发生淬灭，而联吡啶钌的红色荧光不受影响，因此，联吡啶钌标记的J1ER2单克隆抗体存在时，无镉量子点的荧光强度减弱，联吡啶钌标记的J1ER2单克隆抗体与无镉量子点比例关系决定了无镉量子点荧光的信号强度；HER2基因表达量越多，结合的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体越多，离心后上清液中的联吡啶钌标记的J1ER2单克隆抗体越少，发生荧光淬灭的无镉量子点就越少，无镉量子点荧光强度越大，联吡啶钌的荧光强度就越小，两种荧光均可表征J1ER2基因表达量。下面结合附图与实施例对本发明进行进一步阐述。实施例I一、所述的试剂盒中包括(I)抗体稀释缓冲液磷酸与NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的浓度均为0.01mol/L ；(2)孵育缓冲液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的浓度为0. Olmol/L，胎牛血清浓度为5% ；(3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液浓度为I X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/壳量子点的水溶液浓度为2. 0 X 10_6mol/L ；
二、所述的试剂盒的制备I、联吡啶钌标记HER2单克隆抗体的制备将50 ii g的HER2单克隆抗体干粉溶解在500 U L的磷酸盐缓冲溶液中(pH = 8.0),加入NHS(N-Hydroxysuccinimide, N-轻基琥拍酰亚胺)活化的联卩比唳钌固体粉末Img,室温条件下结合反应lh，然后用将结合反应后的溶液转移至50KD的超滤离心管，在离心力为8000g下离心IOmin,收集离心后上清液,即得到连卩比唳钌标记的抗体溶液。2、ZnSe/ZnS核/壳量子点的制备50mL 超纯水中，依次加入 148mg(0. 5mmol) Zn (NO3) 2 *6H20, 276mg (0. 9mmol)GSH(谷胱甘肽)，9mg (0. 05mmol) Na2SeO3,0. 2g 的 NaBH4 (过量)，室温下搅拌 15min,调节 pH = 9. 5，在120°C油浴条件下混合反应70min，即得到ZnSe/ZnS核/壳量 子点水溶液。三、试剂盒的应用用一中的试剂盒对人乳腺导管癌细胞进行检测(I)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液，使联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的浓度为4. OX 10_7mOl/L ;用超纯水稀释ZnSe/ZnS核/壳量子点水溶液，使ZnSe/ZnS核/壳量子点的浓度为2. 0 X 10_8mol/L ；(2)将细胞密度为4. 0 X IO7个/mL的人乳腺导管癌细胞培养液500 y L (细胞数量为20000)与200 ii L浓度为4. 0 X 10^7mol/L的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液混合，再加入IOOu L孵育缓冲液，室温下放置30min，发生抗原抗体特异性结合反应，再用500g离心力低速离心，使抗原抗体结合物沉淀；(3)将步骤(2)中的上清液与200 u L浓度为2. 0 X 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/壳量子点溶液混合，于365nm下观察蓝色荧光，在620nm下观察红色荧光，并用荧光仪于365nm下测量ZnSe/ZnS核/壳量子的荧光强度，在620nm下测量联吡啶钌的荧光强度。将800 u L超纯水与200 u L浓度为2. OX 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/壳量子点溶液混合作为对照。检测结果如图2所示，对照与人乳腺导管癌细胞的ZnSe/ZnS核/壳量子点荧光值相当，20000个乳腺导管癌细胞已经接近了试剂盒测量的上限值，20000个乳腺导管癌细胞中HER2基因的表达量高，此时无法观察到红色荧光，红色荧光信号强度也处于无法检测。实施例2一、所述的试剂盒中包括(I)抗体稀释缓冲液磷酸与NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的浓度均为0.02mol/L ；(2)孵育缓冲液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的浓度为0. 02mol/L，胎牛血清浓度为10% ；(3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液浓度为I X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/壳量子点水溶液浓度为I. 0 X 10_6mol/L ；二、试剂盒的应用用一中的试剂盒对人乳腺癌细胞和人胚肾细胞进行检测(I)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液，使联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的浓度为6. OX KTmol/L ;用超纯水稀释ZnSe/ZnS核/壳量子点的水溶液，使ZnSe/ZnS核/壳量子点的浓度为5. 0 X 10_8mol/L ；
(2)第一组将细胞密度为4. 0 X IO7个/mL的人乳腺癌细胞培养液500 y L (细胞数量为20000)与200 ii L浓度为6. OX KTmol/L的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液混合，再加入100 U L孵育缓冲液，室温下放置30min，发生抗原抗体特异性结合反应，再用500g离心力低速离心，使抗原抗体结合物沉淀； 第二组将细胞密度为4. 0 X IO7个/mL的人胚肾细胞培养液500 y L (细胞数量为20000)与200 ii L浓度为6. OX 10_7mOl/L的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液混合，再加入IOOy L孵育缓冲液，室温下放置45min，发生抗原抗体特异性结合反应，再用800g离心力低速离心，使抗原抗体结合物沉淀；(3)将步骤⑵中的第一组上清液和第二组上清液分别与200ii L浓度为
5.OX 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/壳量子点溶液混合，在620nm下观察红色荧光，并用荧光仪于620nm下测量联吡啶钌的荧光强度。将800 u L超纯水与200 u L浓度为2. 0X 10_8mol/L 的ZnSe/ZnS核/壳量子点溶液混合作为对照。结果如图3所示，人胚肾细胞的红色荧光强度大于乳腺癌细胞的红色荧光强度，乳腺癌细胞J1ER2基因的表达量高于人胚肾细胞HER2基因的表达量，对照组红色荧光无法检测。实施例3一、所述的试剂盒中包括(I)抗体稀释缓冲液磷酸与NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的浓度均为0.03mol/L ；(2)孵育缓冲液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的浓度为0. 03mol/L，胎牛血清浓度为20% ；(3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液浓度为2X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/壳量子点水溶液浓度为2. 0 X 10_6mol/L ；二、试剂盒的应用用一中的试剂盒对不同密度的BT474细胞进行检测(I)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液，使联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的浓度为6. OX 10_7mOl/L ;用超纯水稀释ZnSe/ZnS核/壳量子点水溶液，使ZnSe/ZnS核/壳量子点的浓度为8. 0 X 10_8mol/L ；(2)按照表I的密度将1-14组的BT474细胞培养液500 ii L与200 ii L浓度为
6.OX KTmol/L的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液混合，再加入100 u L孵育缓冲液，室温下放置60min，发生抗原抗体特异性结合反应，再用600g离心力低速离心，使抗原抗体结合物沉淀；表1BT474细胞密度梯度
权利要求
1.一种检测乳腺癌J1ER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括 (1)抗体稀释缓冲液； (2)孵育缓冲液； (3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液； (4)无镉量子点的水溶液； 所述的抗体稀释缓冲液为磷酸-NaCl缓冲液； 所述的孵育缓冲液为磷酸-NaCl-胎牛血清缓冲液。
2.根据权利要求I所述的检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的无镉量子点为ZnSe/ZnS核/壳量子点。
3.根据权利要求I所述的检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释缓冲液中磷酸与NaCl的摩尔比为I : I。
4.根据权利要求3所述的检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释缓冲液中磷酸与NaCl的浓度相同，且为0. 01-0. 03mol/L。
5.根据权利要求I所述的检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的孵育缓冲液含有5% -20%的胎牛血清。
6.根据权利要求I所述的检测乳腺癌HER2基因表达量的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体溶液浓度为I X 10_6mOl/L-2X 10_6mOl/L。
7.一种用权利要求I所述的试剂盒检测乳腺癌HER2基因表达量的方法，其特征在于，具体步骤如下 (1)用抗体稀释缓冲液稀释联吡啶钌标记的J1ER2单克隆抗体的溶液； (2)将待测细胞加入步骤(I)得到的溶液中，再加入孵育缓冲液，室温条件下联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与待测细胞表面的HER2基因表达蛋白发生特异性的结合反应，将特异性结合反应完毕的溶液低速离心，离心后收集上清液； (3)将步骤(2)所得上清液加入无镉量子点的水溶液中，观察无镉量子点荧光，并用荧光光谱仪测定无镉量子点荧光强度或观察联吡啶钌荧光，并用荧光光谱仪测定联吡啶钌荧光强度。
8.根据权利要求7所述的试剂盒使用方法，其特征在于，所述的联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体与所述的无镉量子点摩尔比为I : 20-1 7.5。
9.根据权利要求7所述的试剂盒使用方法，其特征在于，步骤(2)中特异性的结合反应的时间为30-60min。
10.根据权利要求7所述的试剂盒使用方法，其特征在于，步骤(2)中低速离心的离心力为 500_800g。
全文摘要
本发明公开了一种检测乳腺癌HER2基因表达量的方法及其检测试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括(1)抗体稀释缓冲液，(2)孵育缓冲液，(3)联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液，(4)无镉量子点的水溶液。所述的抗体稀释缓冲液为磷酸与NaCl混合配置的磷酸-NaCl缓冲液；所述的孵育缓冲液为所述的抗体稀释缓冲液与胎牛血清混合。实验证明，本发明的检测乳腺癌HER2基因表达量的方法操作简单，灵敏度高，精确度好。
文档编号G01N33/68GK102798724SQ201210279149
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者蔡林涛, 盛宗海, 胡德红, 龚萍, 张鹏飞, 高笃阳 申请人:深圳先进技术研究院