专利名称：液相色谱－串连质谱法测定五加科植物中真菌毒素含量的方法
技术领域：
本发明涉及五加科植物中真菌毒素含量的测定方法，具体涉及采用液相色谱-串连质谱法测定五加科植物中真菌毒素含量的方法。
背景技术：
真菌毒素(Mycotoxin)，也称霉菌毒素，是真菌产生的次级代谢产物，一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经济损失。人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品，或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状。如致幻，催吐，出血症，皮炎，中枢神经受损，甚至死亡。动物试验和流行病学的调查结果还证实，许多真菌毒素还可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒，白细胞缺乏症等，对机体造成永久性损害(参见张艺兵等，农产品中真菌毒素的检测分析[M]北京化学工业出版社，2006)。目前研究关注的真菌毒素主要集中在黄曲霉毒素(aflatoxin)，赭曲霉毒素(0A),呕吐毒素(DON),伏马毒素(FUM),玉米赤霉烯酮(ZEN), T-2毒素及展青霉素(PAT)等。随着对真菌毒素�：Φ纳钊胙芯浚谥鸾ト鲜兜狡涠陨缁峋煤腿死嘟】翟斐傻难现赝玻鞴砸┢肥称分姓婢舅氐姆植技凹觳庖捕加枰粤思蟮墓刈ⅲ乇鹗桥访思懊拦确⒋锕腋嵌源松瓒搜细竦南蘖抗娑�。食品方面，我国已相继出台了很多有关真菌毒素的法定标准(参见GB2715-2005食品中真菌毒素限量[S]和GB2761-2005食品中真菌毒素限量[S])，但在药品领域，除中国药典收载了黄曲霉毒素的检测方法(参见中国人民共和国药典2010年版[S])外，尚无其他标准出台。而已有的食品标准均为针对单一的真菌毒素进行检测，尚无同时检测多成分残留的标准出台。因此，急需开发药品特别是五加科植物中真菌毒素多成分残留的高效测定方法。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种采用液相色谱-串联质谱测定五加科植物中真菌毒素含量的方法。该方法可用于五加科植物中真菌毒素残留的筛查，为拟定药品中真菌毒素的标准提供技术服务。本发明通过如下技术方案实现提供一种用于测定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(I)用固相萃取柱对待测五加科植物样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的五加科植物样品中一种或多种
真菌毒素的含量。根据本发明的一个优选的实施方式，本发明方法用于测定五加科植物样品中多种
真菌毒素的含量。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述五加科植物为人参、西洋参、、竹节参或田七参，特别优选为人参。根据本发明的一个优选的实施方式，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或T-2毒素；其中所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素&、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。根据本发明的一个优选的实施方式，所述五加科植物样品的预处理包括用固相萃取柱Mycos印226多功能柱纯化五加科植物样品的步骤。 根据本发明的一个更优选的实施方式，所述五加科植物样品的预处理包括用乙腈提取五加科植物样品并通过Mycos印226多功能柱的步骤。根据本发明的一个特别优选的实施方式，五加科植物样品的预处理包括称取五加科植物样品粉末，加入乙腈，搅拌，离心，滤过，滤液通过多功能净化柱(Mycosep 226)，取上清液，干燥，加入甲醇-甲酸铵溶液使溶解，离心，取上清液。根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色谱条件为采用十八烷基键合硅胶柱(C18柱)，流动相由A相和B相组成，A相为100%甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。优选地,所述C18柱的粒径为I. 7 5 ii m,柱内径2. I 4. 6mm,柱长为5 IOcm,更优选为ACQUITY UPLC BEH C18柱；B相的浓度为0. 01 0. 05%，优选0. 01% (体积);A B体积比为5 95%: 95 5%，优选流速为0. 2 0. 4ml/min，优选0. 3ml/min。根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100 120伏、碰撞池能量为-39 50伏。本发明方法还包括用各种真菌霉素的标准品绘制标准曲线，并由此计算五加科植物中真菌霉素的含量。本发明方法为首次应用于五加科植物中真菌毒素多成分残留的检测与分析。本发明方法在药品真菌毒素的多成分残留的检测中，可以有效排除干扰、保证待测物的稳定。该测定分析方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于五加科植物中真菌毒素的多成分残留测定。本发明方法通过液相色谱-串连质谱对五加科植物样品进行进样分析，检测五加科植物中多种真菌毒素的残留量，分析成本低、同时又减少了假阳性，提高了测定的准确性，有较强的实用性。该方法对五加科植物中真菌毒素多成分残留的检测具有重要指导意义，对新药等关键技术有良好的指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。该方法可有效应用于国家标准的制订、企业新药的研发、企业现有产品质控方法的提升。
图I为负离子模式的混合标准品溶液的总离子流图；图2为正离子模式的混合标准品溶液的总离子流图；图3为负离子模式的供试品溶液的总离子流图；图4为正离子模式的供试品溶液的总离子流图；图5为负离子模式的加样回收供试品溶液的总离子流图6为正离子模式的加样回收供试品溶液的总离子流图。
具体实施例方式除非另有说明，本发明中所有比例、百分含量和份数都以体积计。实施例II、 材料与方法I. I主要仪器与试剂API 4000串联四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)，ACQUITY UltraPerformance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，MIKRO 200R离心机(德国Hettich公司)，超纯水机(美国Millipore公司)。黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素标准品(美国SUPELC0公司)；乙腈、甲酸、甲酸铵均为色谱纯。Mycos印226多功能净化柱(Romer公司)。人参，购于上海华宇药材有限公司，产地吉林，批号20040404。I. 2实验方法I. 2. I色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18 (I. 7 y m，2. I X 100mm);以 100 % 甲醇为流动相 A 相，以
0.01%甲酸为流动相B相，流速0. 3ml/min ;按下表进行梯度洗脱表I、流动相梯度
权利要求
1.用于测定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)用固相萃取柱对待测五加科植物样品进行预处理； (2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的五加科植物样品中一种或多种真菌毒素的含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)用固相萃取柱对待测五加科植物样品进行预处理； (2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的五加科植物样品中多种真菌毒素的含量。
3.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述五加科植物为人参、西洋参、竹节参或田七参。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述五加科植物为人参。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或T-2毒素。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述黄曲霉毒素选自黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中所述的固相萃取柱为Mycosep 226多功能柱。
8.根据权利要求I或7所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中五加科植物样品的预处理包括用乙腈提取五加科植物样品并通过Mycos印226多功能柱的步骤。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中五加科植物样品的预处理包括以下步骤称取五加科植物样品粉末，加入乙腈，搅拌，离心，滤过，滤液通过Mycosep226多功能柱，取上清液，干燥，加入甲醇-甲酸铵溶液使溶解，离心，取上清液。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色谱条件为采用十八烷基键合硅胶柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。
11.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100 120伏、碰撞池能量为-39 50伏。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述十八烷基键合硅胶柱的粒径为I.7 5 u m,柱内径2. I 4. 6mm,柱长为5 10cm。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为0.01 0. 05%。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为0.01%。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中A B体积比为5 95% 95 5%。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中流动相的流速为0.2 0. 4ml/min,优选 0. 3ml/min。
全文摘要
本发明公开一种液相色谱-串连质谱法测定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)用固相萃取柱对待测五加科植物样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的五加科植物样品中一种或多种真菌毒素的含量。该测定方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于五加科植物中真菌毒素的多成分残留测定。
文档编号G01N30/06GK102654490SQ201210054250
公开日2012年9月5日 申请日期2012年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者夏晶, 季申, 张道广, 李丽敏, 毛丹, 毛秀红, 王少敏, 王柯, 简龙海, 胡青, 许勇, 郑荣 申请人:上海市食品药品检验所
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