专利名称：用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫调节方法和系统，其适于治疗或预防动脉粥样硬化和/或其关联的病况。
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背景技术：
目前动脉粥样硬化被看做是动脉壁的慢性脂质-相关的和免疫-介导的炎症性疾病。已鉴定出参与在动脉粥样硬化形成中的许多免疫组件。临床前期研究已产生了有希望的结果，所述结果表明靶向这些组件的免疫调节疗法可减少动脉粥样硬化。
发明内容
本文提供了用于在个体中诱导免疫调节应答的方法和系统。在若干个实施方式中，由本发明的方法和系统诱导的免疫调节应答与关于个体的动脉粥样硬化或其关联病况的疗治和/或预防作用关联。根据第一个方面，描述了通过Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化的CD8 (+) T细胞以及相关的方法和系统。活化的CD8 (+) T细胞对该免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。根据第二个方面，描述了通过Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化的CD8(+) T细胞用作药剂和特别用在个体中的动脉粥样硬化的治疗和/或预防中。活化的CD8(+)T细胞对免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。该免疫原性片段或其免疫原性活性部分与个体中的动脉粥样硬化减少关联。根据第三个方面，描述了治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化的方法和系统。方法包括给个体施用有效量的通过Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化的CD8(+) T细胞，所述免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联，所述活化的CD8 (+) T细胞对免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。系统包含活化的CD8 (+)T细胞、一种或多种合适的佐剂中的至少两种。根据第四个方面，描述了提供活化的CD8(+)T细胞方法和系统。方法包括在获得对免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8 (+) T细胞的条件下使CD8 (+) T细胞与Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分接触一段时间。在一些实施方式中，其中活化的CD8 (+) T细胞适于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或其关联病况。免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联。系统包含CD8(+)T细胞、Ap0BlOO的免疫原性片段、所述免疫原性片段的免疫原性活性部分和T细胞增强剂中的至少两种。根据第五个方面，描述了包含合适的载体和至少一种本文描述的活化的CD8(+)T细胞的组合物。根据第六个方面，描述了鉴定用于治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化的治疗剂的方法和系统。方法包括在提供活化的CD8(+)T细胞的条件下使CD 8(+)T细胞与Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分接触一段时间，所述活化的CD8(+)T细胞对免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。方法还包括给动物模型施用活化的CD8(+) T细胞并检测在动物模型中的动脉粥样硬化减少。系统包含CD8(+)T细胞、T细胞增强剂、动物模型、检测T细胞活化的试剂和检测动脉粥样硬化减少的试剂中的至少两种。本文描述的T细胞、组合物、方法和系统可用在有关应用中，在所述应用中期望个体中的动脉粥样硬化的斑块减少、斑块生长衰减和/或疗治或预防作用。本发明的一个或多个实施方式的细节在下文的附图
和说明书中阐明。其他特性、目标和优势从说明书和附图和权利要求中显而易见。附图简沭并入本说明书并构成其一部分的附图阐释了本发明的一个或多个实施方式，并与详细的说明书和实施例部分一起用来解释本发明的原理和实施。图I显示了 p210免疫赋予了动脉粥样硬化防护性作用。⑷较之PBS和cBSA/明矾组，用天然P210的免疫导致主动脉动脉粥样硬化显著减少(每一组η = 9-10，示出了来自每一组的代表性图片)。(B)在主动脉窦斑块中，分别通过Μ0ΜΑ-2 (η = 9-10每一组)和⑶Ilc (每一组η = 7-12)免疫反应性评价，Ρ210免疫显著减少了巨噬细胞渗入和DC出现。图2显示了 ρ210免疫对DC的作用。初次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组中，免疫部位处的(A)⑶llc(+)细胞或(B)⑶I Ic (+)^86(+)细胞被显著减少。每一组η = 10。(C)第三次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210免疫的小鼠减少了淋巴结中的⑶I Ic (+)^86(+)细胞(每一组中n = 5 ;AN0VA后进行多个组比较)。图3显示了 p210免疫之前和之后对p210的IgM或IgG滴度(titer)。(A)免疫之前，p210IgG滴度是低的并且安乐死下在PBS组中依然是低的；但在cBSA/明矾和p210/cBSA/明矾组中显著增加，在cBSA/明矾组中具有最高的滴度。⑶在免疫之前p210IgM滴度是低的并在安乐死下显著增加，在小鼠的3个组之间没有差异。6-7周时间点η = 5，25周时间点η = 9。图4显示了体内免疫之后活化的淋巴细胞群。㈧较之PBS或cBSA/明矾组，ρ210/cBSA/明矾组中，淋巴结中的⑶8(+)⑶25(+) T-细胞群显著较高；(B)在三个组之间，淋巴结中的⑶4 (+)⑶25 (+) T-细胞没有差异。(C)在3个组之间，p210/cBSA/明矾组中有脾脏CD8 (+) CD25 (+) IL-10 (+) T-细胞的显著更大的群；(D)在3个组之间的脾脏CD8 (+) CD25 (+)IL12 (+) T-细胞中没有差异。(E) cBSA/明矾组中，脾脏CD4 (+) CD25 (+) IL-10 (+) T-细胞群显著增加，但通过p210/cBSA/明矾免疫，显著衰减；(F)在3个组之间脾脏⑶4(+)^25(+)IL12(+)T-细胞没有差异。㈧和⑶的每一组中η = 9-10 ； (C), (D)、(E)和(F)的每一组中η = 5。图5显示了来自ρ210免疫的供体的⑶8⑴T-细胞的过继转移重演(recapitulate) 了 p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用，而不是通过转移B-细胞或CD4(+)CD25(+)T-细胞。(A)较之来自其他2个组的CD8 (+) T-细胞的受者小鼠，来自p210/cBSA/明矾免疫的供体的CD8(+)T-细胞的受者小鼠发展了显著更小的动脉粥样硬化损害(每一组的η = 9-10)。⑶较之来自PBS或cBSA/明矾组的B-细胞的受者小鼠，来自p210/cBSA/明矾供体的B-细胞的过继转移不会减少动脉粥样硬化(每一组η = 9)。2个不同的剂量(C. I X IO5细胞/小鼠或D. 3X IO5细胞/小鼠)下，CD4(+)CD25(+)T-细胞的受者小鼠(每一组η = 9-13)不会再现ρ210免疫的动脉粥样硬化减少作用。图6显示了来自ρ210免疫的小鼠的CD8(+)T细胞对树突细胞的增加的体外细胞溶解活性。较之来自PBS或BSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞显著具有较高的细胞溶解活性。用来自每一组的每次5只小鼠合并的CD8 (+) T-细胞，重复实验4次。全部地用每一组中的总共11个数据点每次一式两份或一式三份进行。图7显示了，较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的⑶8 (+)T-细胞含有更高水平的粒酶B ;而穿孔素水平没有差异。图8显示了 p210免疫后对KLH或TNP的IgG滴度。较之接受PBS或cBSA/明矾的小鼠，如通过IgG抗体滴度评价的，用p210的在先免疫不会影响随后的(A) T-细胞依赖型(KLH，每一组η = 3-6)或(B) T-细胞非依赖型(ΤΝΡ，每一组η = 4-5)免疫的效力。发明详沭本文描述了适于治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化或其关联病况的T细胞及相关的方法和系统。本文中使用的术语“Τ细胞”表示T淋巴细胞，属于称为淋巴细胞的白细胞的一个组，并参与体液或细胞-介导的免疫中。通过在它们的细胞表面上存在特异性标记物比如T细胞受体(TCR)，Τ细胞可与其他淋巴细胞类型比如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。鉴定T细胞的其他标记物包括⑶la、⑶3、⑶4、⑶8和被技术人员所知道的可能与T细胞状态和/或功能关联的其他标记物。本文中使用的术语“治疗”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为是医药上或手术上对病况的医疗的一部分或医药上或手术上对病况进行处理。本文中使用的术语“预防”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为减少个体中的来自病况的死亡率或发病率负担。这在第一、第二和第三预防水平下发生，其中a)第一预防避免疾病发展；b)第二预防行为的目标在于早期疾病治疗，从而增加干预机会，以预防疾病进展和症状出现；和c)第三预防，通过恢复功能并减少疾病-相关的并发症来减少已确定的疾病的负面影响。本文中使用的术语“动脉粥样硬化”表示下述病况，在所述病况中由于脂肪物质比如胆固醇堆积而导致动脉壁变厚。其是典型地影响动脉血管的综合征，其在很大程度上归因于氧化的脂质、巨噬细胞、活化的淋巴细胞的累积并由低密度脂蛋白(载有胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白)促成。其通常是指动脉的硬化。动脉粥样硬化目前被看做是动脉壁的脂质-相关的和免疫-介导的慢性炎症性疾病。已鉴定出参与在动脉粥样硬化形成中的许多免疫组件并且临床前期研究已产生了有希望的结果，所述结果表明靶向这些组件的免疫调节疗法可减少动脉粥样硬化。策略之一是使用apoB-100相关的肽作为免疫原，并且已针对这种用途鉴定了若干候选肽，见参考文献(I) (2)。本文中使用的术语“病况”(condition)，如其通常所表示的，表示与正常的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)不一致的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)，其中所述正常的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)是与完整的身体、精神和可能地社会福利状态关联的。本文描述的病况包括但不限于病症(disorder)和疾病(disease),其中术语“病症”表示与身体或任何其部分的功能异常关联的活的个体的病况，术语“疾病”表示下述活的个体的病况，其损害身体或任何其部分的正常功能并典型地通过有区别的体征和症状被证明。示例性的病况包括但不限于损伤、失能、病症(包括精神和身体病症)、综合征、感染、个体的反常行为和个体身体或其部分的结构和功能的非典型性变化。本文中使用的关于两个项目的措辞“与…关联的”表示两个项目之间的关系使得第一个项目的发生伴随着第二个项目的发生，其包括但不限于原因-结果关系和体征/症状-疾病关系。本文中使用的术语“个体”表示单个生物体，比如高等动物和特别地脊椎动物(比如哺乳动物)，更特别地人类。在一个实施方式中，描述了通过Ap0BlOO的免疫原性片段活化的⑶8 (+) T细胞，所述活化的CD8(+)T细胞对该免疫原性片段是特异性的。术语“⑶8 (+) T细胞”表示在它们的表面上表达⑶8糖蛋白的T细胞，其中⑶8(分化簇8)糖蛋白是跨膜糖蛋白，其作为T细胞受体(TCR)的辅助受体。类似于TCR，CD8与主要的组织相容性复合体(MHC)分子结合，但对I类MHC蛋白是特异性的。示例性的CD8T细胞包含细胞毒性记忆⑶8T细胞、调控⑶8T细胞、细胞毒性效应⑶8T-细胞和技术人员可鉴定的其他细胞。已鉴定出CD8蛋白的两种亚型 α和β,每一种由不同的基因所编码。在人类中，两种基因都在染色体2上在2ρ12位置中。特别地，在本文描述的T细胞、组合物、方法和系统的一些实施方式中，可使用Ap0BlOO的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化CD8(+)T细胞。本文中使用的术语“活化的”和“活化”表示下述过程，通过所述过程，在导致T细胞在免疫系统内具有预先指定的免疫作用(例如细胞毒性)的条件下，T细胞与提呈(present)特异性抗原的抗原提呈细胞相互作用一段时间。术语“抗原-提呈细胞”(antigen-presenting cell, APC)表示在其表面上显示(display)具有主要的组织相容性复合体(MHC)的抗原复合物的细胞。T-细胞使用其T-细胞受体(TCR)识别该复合物。示例性的APC包含树突细胞(DC)，所述树突细胞已知在连接先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用，见参考文献(3，4)，且这两种免疫应答都参与动脉粥样硬化形成，见参考文献(5), (6)。T细胞，特别是⑶8 (+) T细胞的检测，可通过单独的标记物(比如⑶8)或与TCR和由技术人员可鉴定的其他标记物组合的标记物(比如CD8)的检测来进行。可使用适于检测表面标记物的方法和技术，通过检测T细胞标记物和其他标记物(比如⑶25，⑶44，⑶62和由技术人员可鉴定的其他标记物)，进行活化的CD8(+)T细胞的检测。本文中使用的术语“检测”(动词形式或名词形式)表示在有限部分的空间(包括但不限于样品、反应混合物、分子复合物和底物)中分子或细胞的存在、出现或事实的测定。本文中使用的“检测”(动词形式或名词形式)可包括对目标物的化学和/或生物性质的测定，所述性质包括但不限于与其他化合物相互作用特别是结合的能力、活化其他化合物的能力和当阅读本公开时由技术人员可鉴定的其他性质。检测可以是定量的或定性的。当检测表示、涉及或包括对目标物或信号的数量或量进行测量时，检测是“定量的”(也称为
8定量分析)，其包括但不限于设计来测定目标物或信号的量或比例的任何分析。当检测表示、涉及或包括按照对另一目标物或信号的相对丰度对目标物或信号的品质或种类进行鉴定时，检测是“定性的”，其不是被量化的。适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许检测进行的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物以及由技术人员可鉴定的其他方法和技术。在示例性方法中，通过如在实施例部分中描述的流式细胞分析鉴定T细胞标记物。根据本发明活化的CD8 (+) T细胞是用Ap0BlOO的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化的，并典型地对用于活化的免疫原性片段或免疫原性活性部分是特异性的。本文中使用的关于免疫原性应答的措辞“特异性的”、“特异性地”或“特异性”是指免疫制剂指导对抗原的免疫活性，且实质上较少地指导或不指导对可能存在的其他抗原的免疫活性的能力。因此，本文中的CD8(+)T细胞对用来活化它们的免疫原性片段或活性部分而不是其他抗原是特异地有活性的。可用来鉴定对免疫原性片段特异性的CD8T细胞的示例性的抗原性质包括使用比如在实施例中示例的那些方法和技术以及由技术人员可鉴定的其他方法和技术可检测的体液和/或细胞应答。在本发明的意义上用于检测抗原性质的示例性的方法和系统包含ELISA，特别是血清ELISA和在实施例部分中示例的其他方法。适于检测T细胞标记物的示例性技术包含使用标记有允许检测进行的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物以及由技术人员可鉴定的其他方法和技术。在示例性方法中，通过如在实施例部分中描述的流式细胞分析鉴定T细胞标记物。本文中使用的术语“免疫原性片段”或“抗原片段”表示能产生免疫应答的任何长度的多肽的一部分，比如抗原。抗原是被免疫系统识别的分子。Ap0BlOO的抗原片段因此是呈现抗原性质的apoB-100的一部分。在本发明的意义上术语“ΑροΒΙΟΟ的片段”不仅包括来自Ap0BlOO的任何长度的片段，还包括通过遗传重组或化学合成产生的包含来自Ap0BlOO的序列的肽。在本发明的意义上术语“免疫原性片段”还包括比如突变片段(包括具有替代的、添加的或缺失的残基的片段)、氧化衍生物和/或用MDA或铜处理的肽的任何片段的衍生物，其保持了原片段的可检测的抗原性质(例如特异性的体液和/或细胞应答)。本文中使用的关于第一肽(例如，免疫原性片段)的术语“衍生物”，表示结构上与第一肽相关并通过下述修饰源自第一肽的第二肽，所述修饰引入不在第一肽中存在的特性同时保留第一肽的功能性质。因此，通过对与不在原肽或其部分中存在的其他功能可能或不可能关联的氨基酸序列的修饰，免疫原性片段或其任何部分(例如其表位)的衍生肽通常与原免疫原性片段或其部分不同。但是免疫原性片段或其任何部分的衍生肽保留了本文描述的与免疫原性片段或其部分有关的一种或多种免疫原性活性。用比如已针对免疫原性片段描述的那些方法和系统和对技术人员而言可鉴定的其他方法和系统，可检验抗原性质。典型地，免疫原性片段的衍生物包含免疫原性片段的至少一个表位。在本发明的意义上术语“免疫原性活性部分”表示可引起特异性免疫应答的参照抗原的任何部分。示例性的免疫原性活性部分是典型地通过免疫原性片段内的5个或更多个残基形成的表位。在一些实施方式中，一个或多个片段内的表位可重叠。可通过重组技术(比如用表位标记或亲和力的融合)、游离的或与载体蛋白轭合的寡肽的化学合成、或本领域已知表达ApoB-100肽的任何其他方法，表达免疫原性片段。ΑροΒΙΟΟ的示例性的片段是下述肽，每一种肽包含如在实施例部分中更详细描述的SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :302的序列表中列出的序列之一。适于鉴定在本发明的意义上的免疫原性片段的方法和系统描述在W002/080954中，这里通过引用并入该文献。其他方法在实施例部分中示出(见，例如实施例I)。本文中使用的术语“蛋白”或“多肽”或“肽”表示由两种或多种氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物(包括全长的蛋白或肽)，以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的肽也被称为寡肽。本文中使用的术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指任何二十个氨基酸，包括具有非天然侧链的合成氨基酸并包括D和L两种光学异构体。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个个别原子已用不同的原子、同位素或不同的功能基团替代的氨基酸，但所述氨基酸在其他方面与其天然氨基酸类似物是等同的。在一个实施方式中，ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段与动脉粥样硬化减少关联。特别地，在一些实施方式中，ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段是产生与个体中的或动物模型中的动脉粥样硬化减少关联的免疫应答的免疫原性片段。在这些实施方式的一些中，动脉粥样硬化减少百分比为至少20 %或至少30 %至50 %或40 %至80 %。参考实施例部分，其中示例了与动脉粥样硬化减少约57. 6%关联的免疫原性片段ρ210有关的本发明的实施方式(见，实施例2)。在一些实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的免疫原性片段包含下述肽的至少一种，所述每一种肽包含 Pl (SEQ ID N0:l)、p2(SEQ ID NO :2)、plO (SEQ ID NO 10),pll (SEQ ID NO :11)、p25(SEQ ID NO :25)、p30_p34(SEQ ID NOs :30-34)、p40 (SEQ ID NO:40)、p40(SEQ ID NO :40)、p45 (SEQ ID NO :45)、p68 (SEQ ID NO :68)、p74 (SEQ ID NO :74)、p94(SEQ ID NO :94)、p99(SEQ ID NO :99)、plOO(SEQ ID NO : 100)、pl02(SEQ ID NO :102)、pl03(SEQ ID NO :103)、pl05 (SEQ ID NO : 105)、pl07 (SEQ ID NO :107)、pill (SEQ ID NO:111)、pl29(SEQ ID NO : 129)、pl43 (SEQ ID NO : 143)、pl48(SEQ ID NO : 148)、pl49(SEQ IDNO :149)、pl54 (SEQ ID NO :154)、pl62 (SEQ ID NO :162)、pl69(SEQ ID NO :169)、pl77 (SEQID NO :177)、pl99 (SEQ ID NO : 199)、p210 (SEQ ID NO :210)、p222 (SEQ ID NO :222)、p236(SEQ ID NO :236)、p252 (SEQ ID NO :252)或 p301(SEQ ID NO :301)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 p2 (SEQ ID NO :2)、pll (SEQ ID NO :11)、p32 (SEQ ID NO:32)、p45(SEQ ID NO :45)、p74 (SEQ ID NO :74)、pl02 (SEQ ID NO :102)、pl48 (SEQ ID NO:148)、pl62(SEQ ID NO :162)或p210(SEQ ID NO :210)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含两种肽，其中每一种肽包含P143 (SEQ ID NO :143)或p210(SEQ ID NO :210)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含三种肽，其中每一种肽包含 pll (SEQ ID NO :11)、p25(SEQ ID NO :25)或 p74(SEQ ID NO :74)之一。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含五种肽，其中每一种肽包含 p99(SEQ ID NO :99)、pl00(SEQ ID NO : 100)、pl02 (SEQ ID NO : 102)、pl03 (SEQ ID NO:103) p 105 (SEQ ID NO :105)之一。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 p2 (SEQ ID NO :2)、p45(SEQ ID NO :45)、p74 (SEQ ID NO:74)、pl02(SEQ ID NO :102)或 p210(SEQ ID NO :210)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸16-35 (p2 ；SEQ ID NO :2)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸661-680 (p45 ；SEQ ID NO :45)。在一个实施方式中，与动脉粥样硬化减少关联的一个或多个免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸3136-3155 (P210 ；SEQ ID NO :210)。显示上述肽与动脉粥样硬化减少关联的示例性数据在国际申请WO 02/080954中示出，该文献全文通过引用并入(特别见表I、表2、表A和表B)。特别地，对于这些肽中的一些或其组合物，已检测到减少百分比为64. 6% (P 143和p210)、59. 6% (p 11、p25和p74)、56. 8 % (pl29、pl48 和 pl67)，ρ67· 7(ρ2)、57· 9 % (p210) ,55. 2 % (p301),47. 4% (p45)、31% (pi)(见通过引用全文并入本文的W0/02080954，特别见表B)。在一些实施方式中，在获得对免疫原性片段特异性的CD8(+)T细胞的条件下，可通过使CD8 (+) T细胞与ΑροΒΙΟΟ的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分接触一段时间，来活化本文描述的合适的活化的CD8(+)T细胞。在一个实施方式中，可通过给个体施用有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分体内进行所述接触。在一些实施方式中，有效量可在动物模型中测定。在一些实施方式中，施用后，根据技术人员可鉴定的方法，活化的T细胞从个体(例如从血液或其他液体样品)中分离出。体内活化T细胞的免疫原性片段的有效量取决于其中进行活化的个体，并可被技术人员确定。例如在一个实施方式中，用从约I至约IOOyg的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分进行T细胞活化。在一个实施方式中，用从约I至约IOOmg的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分进行T细胞活化。考虑到进行活化的个体和期望的活化，其他有效量可由技术人员确定。在一个实施方式中，使用合适的技术，比如用适量的免疫原性片段或其活性部分脉冲T细胞，可体外进行所述接触(见例如(41)和(42)，这两篇文献全文通过引用并入本文)。体外活化T细胞的免疫原性片段的有效量可由技术人员确定。例如在一个实施方式中，可用从约I至约100 μ g的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分进行T细胞活化。在一个实施方式中，可通过将⑶8 (+) T细胞与⑶8 (+) T细胞活化的增强剂接触，进行所述接触。当其涉及有关⑶8T细胞的分子时，术语“增强剂”和“增强”是指分子通过促进免疫系统的细胞的活化而改进免疫应答的能力。选择合适的增强剂可允许控制免疫应答的活化。示例性的增强剂包括细胞因子，比如IL-2。本文中使用的术语“细胞因子”是指细胞发信号的分子，其起免疫调节剂的作用并包含蛋白(比如对技术人员而言可被鉴定的白细胞介素和干扰素)。可在体液或细胞的免疫应答的优先诱导中的合适的条件下选择合适的细胞因子。在一个实施方式中，增强剂可以是白细胞介素2 (IL2)、白细胞介素15(IL_15)、TGF- β (TGF- β )、IL2-抗IL-2抗体复合物和/或当阅读本公开时由技术人员可鉴定的其他增强剂。参考参考文献 Mitchell et al 2010(38), Perret et al 2008(39)和 Kamimuraet al 2007(40)描述了有关T细胞活化的增强剂的示例性用途，每一篇文献全文都通过引用并入。特别地，在一些实施方式中，通过由个体中的树突细胞减少⑶86表达和/或IL12分泌，进行所述增强。在若干个实施方式中，可通过在个体中增加对ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+) T细胞，进行个体中的动脉粥样硬化和/或其关联病况的治疗或预防。特别地，在若干个实施方式中，本文描述的p210特异性的CD8(+)或其他活化的CD8 (+) T细胞的增加与动脉粥样硬化斑块中树突细胞的减少关联。更特别地，可通过给个体施用有效量的肽p210(包含序列KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH(SEQ ID NO :210))或本文描述的与个体中的动脉粥样硬化减少关联的另一种免疫原性片段，进行特异性CD8(+)T细胞的这种增加。在一个实施方式中,可通过给个体施用有效量的活化的CD8(+)T细胞进行所述增加。在一个实施方式中，有效量被期望包含在约500，000个至2，000, 000个之间的细胞。在实施方式中，有效量被期望包含在约750，000个至约1，500, 000个之间的细胞。在一个实施方式中，有效量被期望为约1，000, 000个细胞。特别地，在一个实施方式中，期望施用约1，000，000个细胞以导致动脉粥样硬化的治疗和预防二者。施用被期望按照剂量和程序表进行，所述剂量和程序表基于将被治疗的个体的病况和期望的作用而被确定。例如在用于预防的施用中，可以通过单次施用或以一定的时间间隔多次施用(例如3次施用或更多次，特别地高至6次施用)本文描述的活化的CD8 (+) T细胞，来进行有效量的活化的CD8 (+) T细胞的施用，从而获得基于个体的病况的期望免疫。特别地，无论什么时候期望延长作用，可进行多次施用。按照对技术人员而言使个体免疫的可鉴定的方法，进行本文描述的CD8(+)T细胞的施用。在一个实施方式中，可通过胃肠外施用进行施用。胃肠外施用是通过消化道之外的途径给出物质的全身性施用途径，其包括但不限于静脉注射施用、动脉内施用、肌肉注射施用、皮下施用、真皮内施用、腹膜内施用和膀胱内输注。特别地，在一个实施方式中，可通过静脉注射施用进行施用。在一个实施方式中，可通过一次施用活化的⑶8(+)T细胞，典型地由静脉注射途径，进行施用，取决于期望的免疫作用的持续时间可以施用一次或多次。在一个实施方式中，如果与ΑροΒΙΟΟ的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分(单独地，或连同CD8(+)T细胞增强剂(比如IL 2))组合进行，施用CD8(+)T细胞被期望是特别有用的。特别地，在一些实施方式中，还可通过施用本文描述的活化的CD8 (+)
12T细胞和可能与本文描述的增强剂组合的本文描述的ΑροΒΙΟΟ的任何免疫原性片段的任何组合物，进行施用。在一个实施方式中，增加个体中的活化的CD8(+)T细胞(活化的CD8(+)T细胞对ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的)被期望导致斑块、树突细胞含量和/或巨噬细胞含量减少。根据一种可能的机制(提供该机制仅用于指导目的并且不意图进行限制)，动脉壁中的危险信号(比如氧化的LDL、热激蛋白)可激活DC或另一 APC，其诱导效应T-细胞，随后活化免疫-介导的炎症性级联和介质，导致动脉粥样硬化斑块生长或不稳定，见参考文献(7)、(8)。这种DC进入动脉壁的减少可与减少的动脉粥样硬化相关。还在一些实施方式中，通过调节个体中的树突细胞表型以产生耐受性树突细胞，进行增强。另外，在若干个实施方式中，呈现动脉粥样硬化和/或其关联病况的个体可通过增强个体中的T调控细胞群而被治疗。在一个实施方式中，CD8(+) T细胞可用在鉴定用于治疗和/或预防动脉粥样硬化或其关联病况的治疗剂的方法中。方法包括使CD8 (+) T细胞与ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段或其免疫原性活性部分在提供活化的CD8 (+) T细胞的条件下接触一段时间，活化的CD8 (+) T细胞对该免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。方法还包括给动物模型施用活化的CD8 (+) T细胞并检测在动物模型中的动脉粥样硬化减少。本文中使用的术语“动物模型”表示为了更好地了解疾病而不增加在进行期间对实际人类引起伤害的风险，在研究和调查人类疾病期间使用的活的非人类动物。为了以类似人类生理学的方式对疾病或其治疗起作用，选择的动物通常满足确定的人类的分类学等同性。使用动物模型，已开发了针对人类疾病的许多药物、治疗和疗法(cures)。在开发过程的探索和研究中代表具体的分类组的动物模型也被称为模型生物体。在一个实施方式中，可通过免疫组织化学和组织形态测量技术比如在实施例部分中阐释的那些，进行动物模型中的动脉粥样硬化减少检测。可通过成像技术比如颈动脉内膜厚度的超声测定、颈动脉动脉粥样硬化的MRI扫描、冠状或外周动脉循环的CT血管造影，进行人类中的动脉粥样硬化减少的检测。与在动物模型中的施用后与动脉粥样硬化减少关联的免疫原性片段和/或其免疫原性活性部分和因此活化的CD8(+)T细胞可被选择作为用于治疗或预防动脉粥样硬化的治疗剂。特别地在一些实施方式中，与减少至少约20%动脉粥样硬化关联的免疫原性片段或其免疫原性部分或因此活化的CD8(+)T细胞可被选择作为治疗剂。在一个实施方式中，减少百分比可以为约30%至50%或约40%至80%。如本文中公开的，CD8(+)T细胞、免疫原性片段或其免疫原性活性部分和本文描述的增强剂可被提供作为治疗和/或预防动脉粥样硬化或其关联病况的系统的一部分或作为鉴定治疗和/或预防动脉粥样硬化或其关联病况中的治疗剂的系统的一部分。在一些实施方式中，系统包含下述的两种或多种适于在个体中增加活化的CD8(+) T细胞的一种或多种试剂和/或适于检测个体中的增加的CD8 (+)T细胞的一种或多种试剂。在一些实施方式中，系统包含下述的两种或多种适于在个体中增加对ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段特异性的活化的CD8(+)T细胞的一种或多种试剂和适于检测个体中的减少的斑块、树突细胞含量和/或巨噬细胞含量的一种或多种试剂。系统可以试剂盒部件的形式提供。在试剂盒部件中，进行本文描述的方法的本文描述的CD8 (+) T细胞和其他试剂可以独立地包含在试剂盒中。本文描述的CD8 (+) T细胞可包含在一种或多种组合物中并且每一种本文描述的CD8(+)T细胞可连同合适的载体存在于组合物中。其他组件可包括，单独的或组合的本文描述的免疫原性片段或其免疫原性活性部分的任何一种、增强剂(例如IL2、IL15、IL2-抗IL2抗体复合物)、佐剂(例如铝盐，通常是铝盐佐剂)、能检测本文描述的CD8(+)T细胞的试剂、能检测减少的斑块的试剂(比如标记的分子，特别是标记的抗体、标记物、微流控芯片、参照标准物)和当阅读本公开时技术人员可确定的其他组件。本文中使用的作为复合物部件或分子的术语“标记”和“标记的分子”是指能检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶、配体(比如生物素、抗生素蛋白、抗生蛋白链菌素或半抗原)等等。术语“荧光团”是指能在可检测的图像中显示荧光的物质或其部分。因此，本文中使用的措辞“标记信号”表示从允许标记检测的标记发射的信号，包括但不限于放射性、荧光、化学发光、在酶反应结果中产生化合物等等。在一个实施方式中，该系统用于增加个体中的CD8(+)T细胞(例如用于产生CD8(+)T细胞)且系统包含下述的两种或多种适于增加个体中的活化的CD8(+) T细胞的一种或多种试剂和/或适于在个体中检测增加的CD8(+)T细胞的一种或多种试剂。在一个实施方式中，该系统用于减少斑块、树突细胞含量和/或巨曬细胞含量(例如在个体中用于疗治目的或在动物模型用于生物研究目的)并且系统包含下述的两种或多种适于在个体中增加对ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+)T细胞的一种或多种试剂和适于在个体中检测减少的斑块、树突细胞含量和/或巨曬细胞含量的一种或多种试剂。在一些实施方式中，本文描述的⑶8 (+) T细胞的检测也可通过基于荧光的读出器进行，其中标记的抗体用荧光团标记，所述荧光团包括(但并非穷尽性地)，小分子染料、蛋白发色团、量子点和金纳米颗粒。当阅读本公开时其他技术可由技术人员确定并将不会进一步详细地讨论。特别地，为了进行本文描述的方法，可提供具有合适的说明书和其他必要试剂的试剂盒的组件。试剂盒通�：性诘ザ赖娜萜髦械淖楹衔�。在试剂盒中通常包括用于进行检验的在纸上或电子支持物(比如磁带或CD-ROM)上的说明书，例如书面说明书或音频说明书。取决于使用的特别的方法，试剂盒还可含有其他包装的试剂和材料(例如洗涤缓冲液等等)。在一些实施方式中，本文描述的⑶8 (+) T细胞可与合适的载体一起包括在组合物中。本文中使用的术语“载体”表示就包含在组合物中作为活性成分的T细胞而言通常作为溶剂、载剂、粘合剂或稀释剂的各种介质的任何介质。在其中组合物被施用给个体的一些实施方式中，组合物可以是药物抗-炎症性组合物并包含T细胞和药物可接受的载体。
特别地，在一些实施方式中，本文公开了药物组合物，其含有与一种或多种相容的药物可接受的载体组合的，特别是与药物可接受的稀释剂或赋形剂组合的，本文描述的至少一种CD8(+)T细胞。在这些药物组合物中，本文描述的CD8(+)T细胞可作为活性成分被施用，用于治疗或预防个体的病况。本文中使用的术语“赋形剂”表示用作药物活性成分的载剂的非活性物质。本文公开的用于医药组合物的合适的赋形剂包括增强个体身体吸收本文描述的CD8(+)T细胞的能力的任何物质。合适的赋形剂还包括可用来增大含有CD8(+) T细胞的配方量以允许便利的、准确的剂量的任何物质。除了它们在单剂量中的用途，赋形剂可在制造过程中使用，以帮助处理本文描述的CD8(+)T细胞。取决于施用的途径和医药形式，可使用不同的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于抗粘着剂、粘合剂、涂覆崩解剂、填充剂、香料(比如甜味剂)和颜料、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸着剂。本文中使用的术语“稀释剂”表示用于稀释或携带组合物的活性成分的稀释试剂。合适的稀释剂包括可降低医药制剂的粘性的任何物质。在一个实施方式中，本文描述的组合物还可包括佐剂。本文中使用的术语“佐剂”表示可刺激免疫系统并增加对疫苗的应答，而其本身不具有任何特异性抗原作用的试剂。措辞“佐剂”来自拉丁文ad juvare，其意思是帮忙或帮助。典型地，免疫学佐剂被定义为当与特异性疫苗抗原组合使用时起加速、延长或增强抗原-特异性免疫应答作用的任何物质。通过仅阐释有关的实验部分的方式，本发明的其他优势和和特征将从下文详细公开中更加显而易见。
实施例本文描述的方法和系统在下述实施例中进一步阐释，所述方法和系统通过阐释的方式提供并且不是意图限制。特别地，下述实施例阐释了示例性的CD8(+) T细胞和相关的活化方法以及治疗或预防动脉粥样硬化的用途。更特别地，示出了用免疫原性片段P210进行的CD8 (+) T细胞活化，以及这样获得的CD8(+)T细胞用来在小鼠模型中治疗和预防动脉粥样硬化的用途。本领域技术人员将意识到使本部分详细描述的特征适合于其他免疫原性片段的可行性和必要的改进，所述免疫原性片段按照本发明的实施方式皮下施用或使用其他施用途径体内或体外施用。除非另外指出，下述材料和方法用在下文报告的实施例中。肽的选择及用于免疫的肽的制备已报道了人类apoB-100肽的确定和筛选(8)。基于申请人的初步试验和先前报道，见参考文献(9)、(10)，申请人选择了 210 (p210，KTTKQSFDLS VKAQY KKNKH-SEQ ID NO :210)作为候选免疫原。使用先前描述的方法，见参考文献
(3)、(4),使天然p210肽(Euro-Diagnostica AB, Sweden)与用作载体的阳离子牛血清白蛋白(cBSA)轭合，明矾被用作佐剂并与肽/cBSA轭合物用体积比I : I的比率混合。肽轭合物以及与明矾的混合物在每次免疫之前新鲜制备。免疫方案雄性apoE-/-)小鼠(Jackson实验室)饲养在由美国实验室动物管理认证协会(American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care)认可的动物设施中，并在无限制得到水和食物的12-小时的白天/晚上周期上喂养。Cedars-Sinai医学中心的实验动物护理与使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee of Cedars-Sinai Medical Center)批准了实验方案。在初步实验中,较之25或SOyg剂量，使用100 μ g剂量的p210免疫赋予了最佳的动脉粥样硬化-减少。因此100 μ g剂量被用于所有随后的实验。在正常食物膳食上饲养的小鼠，在6-7周龄时在肩胛骨之间的背部区域中接受皮下的初次免疫，随后在9和12周龄时加强剂量。最后一次加强剂量后一周，膳食被转变为高胆固醇食物(TD 88137，Harlan-Teklad)并继续直到在25周龄时安乐死。在相同的免疫时间点下接受PBS或cBSA/明矾的单独组的小鼠作为对照。一些小鼠在8或13周龄时被处死以评价对p210的免疫应答。组织收获和制备安乐死下，收获心脏并嵌入OCT化合物(Tissue-Tek)中用于冷冻切片。全部的主动脉被清洁、处理并用油红O染色以用计算机辅助的组织形态测量技术前位分析(en face)来评价动脉粥样硬化程度，见参考文献(3)、(4)。免疫组织化学和组织形态测量使用标准方案，将来自主动脉窦的切片用M0MA-2 (Serotec)或⑶lie (eBioscience)抗体染色，以通免疫组织化学鉴定巨噬细胞或树突细胞。使用标准方案进行针对斑块尺寸的油红O染色。如前述的进行计算机辅助的形态测量分析来评价组织形态，见参考文献(3)、(4)。血清ELISA使用标准方案,将平底96-孔聚苯乙烯平板(MaxiSorp, Germany)分别用 100 μ 1(2μ g/ml)p210、KLH、TNP-KLH(Biosearch Technologies T-5060)或 BSA (针对IgG为2 μ g/ml或针对IgM为10 μ g/ml)预先涂覆，在4°C孵育过夜，以评价抗体水平。涂覆浓度在初步实验中被最佳化。山羊抗-小鼠HRP-IgG(Pierce 31437)或IgM(SouthernBiotech)被用作检测抗体并通过在作为底物的ABTS (Southern Biotech)中显影检测结合的抗体，并在405nm下记录光密度值。流式细胞计量分析使用标准方案用下文表I中列出的抗体和FACScan(BectonDickinson)或CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)进行流式细胞计量分析。对于细胞内的细胞因子染色，将Brefeldin A (3 μ g/ml)添加至培养的细胞2小时，之后细胞经受染色程序。细胞膜被可渗透化处理用于染色细胞内的分子。表I
权利要求
1.被Ap0BlOO的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化的CD8(+)T细胞，所述活化的CD8(+) T细胞对所述一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的。
2.根据权利要求I的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段选自下述肽组其中每一种肽具有SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :302之
3.根据权利要求I或2的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联。
4.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 EQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ IDNO 25, SEQ ID NOs :30-34, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 74,SEQ ID NO : 94、SEQ ID NO : 99、SEQ ID NO 100,SEQ ID NO 102,SEQ ID NO:103、SEQ ID NO :105、SEQ ID NO :107、SEQ ID NO :111、SEQ ID NO :129、SEQ ID NO :143、SEQ ID NO :148,SEQ ID NO 149,SEQ ID NO : 154、SEQ ID NO 162,SEQ ID NO :169、SEQ IDNO :177,SEQ ID NO :199、SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :222、SEQ ID NO :236、SEQ ID NO :252和 SEQ ID NO :301 之一。
5.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 45, SEQID NO 74, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 148, SEQ ID NO :162 和 SEQ ID NO :210 之一。
6.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO :143的肽和具有SEQ ID NO :210的肽。
7.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO 11的肽、具有SEQ ID NO 25的肽和具有SEQ ID NO 74的肽。
8.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO 99 的肽、具有 SEQ ID NO :100 的肽、具有 SEQ ID NO :102 的肽、具有 SEQ ID NO :103的肽和具有SEQ ID NO :105的肽。
9.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO 2 的肽。
10.根据权利要求3的CD8(+) T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO 45 的肽。
11.根据权利要求3的CD8(+)T细胞，其中所述一个或多个免疫原性片段包含具有SEQID NO :210 的肽。
12.根据权利要求3至11的任一项的⑶8(+) T细胞，其用作药剂。
13.根据权利要求3至11的任一项的CD8(+)T细胞，其用在个体的动脉粥样硬化的治疗和/或预防中。
14.根据权利要求13的CD8(+) T细胞，其中治疗包括给个体施用有效量的CD8 (+) T细胞。
15.根据权利要求14的⑶8(+) T细胞，其中有效量包含在约500，000至约2，000, 000之间的活化的CD8 (+)T细胞。
16.根据权利要求14的CD8(+)T细胞，其中有效量是约1，500,000个活化的CD8(+)T细胞。
17.根据权利要求14至16的任一项的CD8(+)T细胞，其中所述施用是胃肠外进行的。
18.包含根据权利要求I至11的任一项的活化的CD8(+)T细胞和合适的载体的组合物。
19.包含根据权利要求3至11的任一项的活化的⑶8(+) T细胞和药物可接受的载体的药物组合物。
20.提供适于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或其关联病况的活化的CD8(+) T细胞的方法，所述方法包括使CD8 (+) T细胞与Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分在获得对所述免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞的条件下接触一段时间，所述免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联。
21.根据权利要求20的方法，其中通过用约100μ g的免疫原性片段对⑶8 (+) T细胞脉冲来体外进行所述接触。
22.根据权利要求20的方法，其中所述接触在非人类动物中体内进行，所述接触通过给非人类动物施用有效量的所述免疫原性片段或其免疫原性活性部分进行。
23.根据权利要求20至22的任一项的方法，其中与⑶8(+) T细胞增强剂组合进行所述接触。
24.鉴定用于在个体中治疗和/或预防动脉粥样硬化的治疗剂的方法，所述方法包括使CD 8 (+)T细胞与Ap0BlOO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分在提供活化的CD8 (+) T细胞的条件下接触一段时间，所述活化的CD8(+) T细胞对所述免疫原性片段或其免疫原性活性部分是特异性的；以及对动物模型施用所述活化的CD8 (+) T细胞并检测在动物模型中的动脉粥样硬化减少。
25.治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化的系统，该系统包含在治疗或预防个体中的动脉粥样硬化的方法中同时组合使用的或顺序使用的下述的两种或多种根据权利要求3至11的任一项的一种或多种⑶8(+)T细胞；和一种或多种佐剂；所述方法包括施用与一种或多种合适的佐剂组合的根据权利要求3至11的任一项的一种或多种⑶8 (+)Τ细胞。
26.提供活化的⑶8(+) T细胞的系统，所述系统包含在根据权利要求20至23的任何一项的方法中同时组合使用的或顺序使用的下述至少两种一种或多种⑶8 (+)Τ细胞，Ap0BlOO的一个或多个免疫原性片段或其免疫原性活性部分，和一种或多种T细胞增强剂。
27.根据权利要求26的系统，其中Ap0BlOO的一个或多个免疫原性片段包含多种肽，其中每一种肽具有选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :302的序列。
28.根据权利要求26或27的系统，其中所述一种或多种T细胞增强剂包含IL2、IL15和IL2-抗IL2-抗体复合物中的一种或多种。
29.鉴定用于治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化的治疗剂的系统，所述系统包含在权利要求24的方法中同时组合使用的或顺序使用的CD8 (+) T细胞、T细胞增强剂、动物模型、检测T细胞活化的试剂和检测动脉粥样硬化减少的试剂中的至少两种。
30.根据权利要求29的系统，其中所述动物模型是小鼠。
全文摘要
用于在个体中治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或其关联的病况的免疫调节T细胞、组合物、方法和系统。
文档编号G01N33/50GK102939536SQ201080061637
公开日2013年2月20日 申请日期2010年11月12日 优先权日2009年11月14日
发明者匡-宇·邱, 普里迪曼·K·沙赫 申请人:匡-宇·邱, 普里迪曼·K·沙赫
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