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专利名称：一种快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体说ー种快速鉴定检疫性杂草假高粱种子与同属近缘种种子的技术方法。
背景技术：
假高粱(Sorghum halepense (L. ) Pers)是禾本科高粱属多年生杂草,假高粱原产于地中海地区,是世界上�：Υ�、难防除的10大恶性杂草之一。假高粱的分蘖能力强，根茎发达，地下根茎扩展范围广，难以拔除，假高粱主要以地下茎和种子进行繁殖，其地下根茎具有強大的繁殖力，即使将其根茎切成小段，只要有节，仍能长出新芽。ー棵假高粱植株可产28000粒种子，且籽实易于脱落，常混杂于播种材料或商品粮中传播，特别是易随含有假高粱的商品粮加工后的下脚料传播扩散；也可随水流、农具、动物等传播。而且假高粱毎年4月至10月都能开花结籽，这也使假高粱更难以控制。而且假高粱为高粱属等作物的害虫和植病提供寄主。假高粱是高粱瘿蚊(Contariniasorghicola)的中间寄主,是葡萄座腔菌属(Botryosphaeria sp.)及紫柄锈菌(Pucciniapurpurea)的转座寄主。假高粱也是引起稻田叶瘿、玉米叶瘿、水稻条纹病、甘鹿花叶病、甜菜黄化病等病毒的转座寄主[8-11]。此外，假高粱的花粉易与留种的高粱属作物杂交，使产量降低，品种变劣，给农业生产带来极大的�：�。假高粱的分泌物或腐烂的叶子，地下茎，根等能抑制作物种子萌发和籽苗生长。据报道，假高粱在美国毎年造成玉米、大豆、棉花等其他作物减产45%。除对作物有严重影响外，假高粱幼苗中所积聚的氰化物(氢氰酸)对牲畜及人都有直接或间接的威胁。因此，我国农业部早在1995年就将假高粱列为我国的检疫对象，是载入贸易合同的我国进ロ植物检疫对象。由于高粱与苏丹草属于农作物或饲料植物，黑高粱虽然也是ー种农业杂草，但是该种的检疫地位不明确。并且假高粱与其他3种植物形态相似，因此在对外检疫中一定要正确无误、快速地鉴别出假高梁及其近缘种。但是，假高粱种子及其近缘种苏丹草、高粱和黑高粱的形态极为相似，如何有效，快速地区分假高粱与其近缘植物的种子越来越来成为各国家检疫部门关注的焦点。目前主要通过形态学观察、染色体计数和核型、生物化学方法和分子标记的方法来区别假高粱与近缘植物的种子。但是，由于高粱属植物种子相似，形态上难于有效区别，而且这种方法的有效性基于长期的工作经验；假高粱与黑高粱等染色体数相同，核型上极为相似，更为主要的，核型分析需要根尖幼芽，操作复杂，用到的试剂药品毒性较大，而且实际实施起来需要多达几周的时间，难以满足货物快速通关的要求；生物化学和分子生物学方法涉及药品多，操作复杂，分子标记等生物化学方法实施起来又需要较长时间和特殊设备，费用也高。因此，需要ー种快速、简别地鉴别假高粱与近缘植物种子的有效方法。尤其是待鉴定物种为高粱、黑高粱和苏丹草时，应尽快用简捷的方式确认，排除它是假高粱的可能性
发明内容
本发明的目的是提供ー种快速、正确、鉴别假高粱与近缘种种子的技术方法。本发明检测假高粱种子和假高粱的近缘种种子的有机溶剂(优选石油醚)浸溃液紫外吸光度，基于63个敏感波段的紫外吸光度数据，借助于生态学统计软件PC-ORD中的聚类分析�？�(Cluster Analysis),作出假高粱与近缘种的聚类分析图。同样检测敏感波段下目标种子的紫外吸光度数据，根据聚类图上与假高粱组的图形位置关系，判别目标种子是否是假高粱。技术方案为ー种快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，包括如下步骤(I)取目标种子在有机溶剂中浸泡，取浸溃液；优选的，浸溃液的制备方法为目标种子与有机溶剂混合，15 30°C下浸泡2 3小吋，过滤；待鉴别种子与有机溶剂的用量比为Ig 50 500ml ;有机溶剂优选为石油醚；
(2)步骤(I)的浸溃液在紫外分光光度计下检測，以空白有机溶剂为对照，检测在63个波段上的紫外吸收光度数据，与假高粱标准品的数据比对，判断目标种子是否为假高粱；所述的 63 个波段为:283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm ；优选的，根据上述63个敏感波段上的紫外吸收光度数据，应用聚类分析�？椋�选择�？橹信肥暇嗬胱魑�距离測度，用离差平方和法作为聚类策略，生成假高粱和目标种子相似关系的聚类分析图；根据聚类图上目标种子与假高粱组的图形位置关系，判别识别目标种子是否是假高粱；优选的，将待鉴定的目标种子浸溃液在所述63个波段上的紫外吸收光度数据与近缘植物(高粱、黑高粱和苏丹草)比对，判断待鉴别的目标种子是否为近缘植物；具体为应用聚类分析�？椋�选择模块中欧氏距离作为距离測度，用离差平方和法作为聚类策略，生成近缘植物和待鉴定目标种子相似关系的聚类分析图；根据聚类图上目标种子与近缘植物组的图形位置关系，判别待鉴定的目标种子是否为近缘植物；如果判断目标种子为近缘植物中的ー种，则判断待鉴定的目标种子不是假高粱。紫外吸光度的检测方法是将上述浸溃液置于石英比色杯(优选为Icm)中，以相应溶剂做空白对照，在紫外分光光度计上扫描。波长范围200 400nm ;狭缝Inm ;扫描速度0. 5s/SCAN，获取不同波段上的紫外吸光度值。本发明的第三个方面，是公布了能够鉴别假高粱与其近缘种种子的63个紫外吸收敏感波段，这些波段(nm)分别是 283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400。本发明通过溶剂提取浸溃，获取假高梁及近缘种植物的种子浸溃液，再检测它们不同波段上的紫外吸光度值，通过方差分析进ー步筛选出假高粱与近缘种在吸光度上存在显著差异的敏感波段，再基于这些波段上的吸光度数据，应用计算机软件生成假高粱及其需要鉴定的目标物种的聚类分析图，进而分析鉴别，将假高粱与其近缘物种区分开，以鉴定目标物种。
本发明利用有机溶剂浸溃待鉴定目标物种的种子，基于63个敏感波段上的紫外吸光度数据，通过对比可以快速方便地鉴定目标物种是否为假高粱；假高粱在这63个敏感波段上的差别显著，很容易与近缘物种区别开来。如果检测结果同高粱、黑高粱或苏丹草一致，则可以立即排除目标物种为假高粱的可能性，鉴定方法简单，结果可靠，成本低，可避免因鉴定错误造成的损失，在植物检疫检验中有重要意义。


图I为实施例I假高粱与黑高粱的类聚分析图
图2为实施例2假高粱与高粱的类聚分析3为实施例3假高粱与苏丹草的类聚分析4为基于63个敏感波段上紫外分光光度计吸光度作出的能够识别假高粱与其他三个近缘种子的波谱图，曲线自上而下依次为黑高粱、假高粱、高粱和苏丹草。
具体实施例方式I)精密称取假高粱与需要识别的近缘种子各3份，每份O. 2g，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入20 50ml分析纯石油醚，密塞，室温放置，浸泡2. 5h，过滤，根据滤液情况作稀释至100ml,置Icm石英比色杯中，以相应溶剂做空白对照,在紫外分光光度计(unicamuv540型紫外分光光度计)上扫描。波长范围200 — 400nm;狭缝Inm;扫描速度0. 5s/SCAN，获取200个不同波段上的紫外吸光度值。2)从步骤I)中得到的200个波长的吸光度数据中，选择63个敏感波段(283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、
302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm)上的吸光度数据，应用PC-0RD软件中聚类分析�？�(Cluster Analysis),选择�？橹信肥暇嗬�(Euclidean)作为距离测度,用离差平方和法(Ward’ method)作为聚类策略，生成假高粱和需要鉴定物种相似关系的聚类分析图。根据聚类图上与假高粱组的图形位置关系，判别识别对象是否是假高粱。以下通过实施例进ー步说明本发明，但应理解，这些实施例只是示例性的，本发明并不局限于此。实施例I假高粱与黑高粱的区别称取假高粱种子、以及需要鉴定的目标物种(此处是黑高粱)各3份，每份O. 2g,加Λ 30ml分析纯石油醚，在25°C下放置浸泡2. 5h，过滤，稀释至100ml。将以上石油醚提取液置Icm石英比色杯中，以相应溶剂做空白对照,在紫外分光光度计(unicam uv540型紫外分光光度计)上扫描。波长范围200— 400nm ;狭缝lnm;扫描速度0. 5s/SCAN，获取283、
284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、
303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、
322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm的吸光度数据(见附表)。基于63个敏感波段的6组紫外吸光度数据，应用生态学统计软件PC-ORD中的聚类分析�？椋�以欧氏距离为6组吸光度数据相似性測度，应用离差平方和法作聚类策略，生成聚类图如图I所示，图上清楚地能够将假高粱(三組)与黑高粱区别开来。实施例2假高粱与高粱的区别
称取假高粱种子、以及需要鉴定的目标物种(此处是高粱)各3份，每份O. 2g,加入30ml分析纯石油醚，在25°C下放置浸泡2. 5h，过滤，稀释至100ml。将以上石油醚提取液置Icm石英比色杯中，以相应溶剂做空白对照,在紫外分光光度计(unicam uv540型紫外分光光度计)上扫描。波长范围200 — 400nm;狭缝lnm;扫描速度0. 5s/SCAN，获取283、
284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、
303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、
322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm的吸光度数据(见附表)。基于63个敏感波段的6组紫外吸光度数据，应用生态学统计软件PC-ORD中的聚类分析�？椋�以欧氏距离为6组吸光度数据相似性測度，应用离差平方和法作聚类策略，生成聚类图如图2所示，图上清楚地能够将假高粱(三組)与高粱区别开来。实施例3假高粱与苏丹草的区别称取假高粱种子、以及需要鉴定的目标物种(此处是苏丹草)各3份，每份O. 2g,加Λ 30ml纯石油醚，在25°C下放置浸泡2.5h，过滤，稀释至100ml。将以上石油醚提取液置Icm石英比色杯中，以相应溶剂做空白对照,在紫外分光光度计(unicam uv540型紫外分光光度计)上扫描。波长范围200— 400nm ;狭缝lnm;扫描速度O. 5s/SCAN，获取283、284、
285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、
304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、
323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm的吸光度数据(见附表)。基于63个敏感波段的6组紫外吸光度数据，应用生态学统计软件PC-ORD中的聚类分析�？椋�以欧氏距离为6组吸光度数据相似性测度，应用离差平方和法作聚类策略，生成聚类图如图3所示，图上清楚地能够将假高粱(三组)与苏丹草区别开来。表I和表2分别为假高粱、高粱、苏丹草和黑高粱种子石油醚提取液(浸溃液)在200-400nm波段及63个敏感波段上的吸光度数据。假高粱、高粱、苏丹草和黑高粱种子石油醚提取液(浸溃液)基于63个敏感波段上的吸光度数据波谱图如图4所示，能将假高粱与其他3个近缘种子区别开。表I.假高粱、高粱、苏丹草和黑高粱种子石油醚提取液在200_400nm波段上的吸
光度数据
权利要求
1.一种快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，包括如下步骤 (I)取目标种子在有机溶剂中浸泡提�。�取浸溃液； (2 )步骤(I)的浸溃液在紫外分光光度计下检测，以空白有机溶剂为对照，检测在63个波段上的紫外吸收光度数据，与假高粱标准品的数据比对，判断目标种子是否为假高粱；所述的 63 个波段为:283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、342、349、354、362、366、369、379、384、385、387、390、399、400nm。
2.权利要求I所述快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，步骤(I)中所述浸溃液的制备方法为目标种子与有机溶剂混合，15 30°C下浸泡2 3小时，过滤；待鉴别种子与石油醚的用量比为Ig 50 500ml。
3.权利要求I所述快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，步骤(2)中根据所述63个波段上的紫外吸收光度数据，应用聚类分析�？椋�选择�？橹信肥暇嗬胱魑�距离测度，用离差平方和法作为聚类策略，生成假高粱和目标种子相似关系的聚类分析图；根据聚类图上目标种子与假高粱组的图形位置关系，判别识别目标种子是否是假高粱。
4.权利要求I所述快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，步骤(2)中的目标种子浸溃液在所述63个波段上的紫外吸收光度数据与近缘植物比对，判断目标种子是否为近缘植物。
5.权利要求4所述快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，所述的近缘植物为高粱、苏丹草或黑高粱。
6.权利要求4或5所述快速鉴别假高粱及近缘植物种子的方法，其特征在于，根据所述63个波段上的紫外吸收光度数据，应用聚类分析�？椋�选择�？橹信肥暇嗬胱魑�距离测度，用离差平方和法作为聚类策略，生成近缘植物和目标种子相似关系的聚类分析图；根据聚类图上目标种子与近缘植物组的图形位置关系，判别目标种子是否为近缘植物；如果判断目标种子为近缘植物中的一种，则判断目标种子不是假高粱。
全文摘要
本发明提供一种快速、正确、鉴别假高粱与近缘植物种子的技术方法。通过溶剂提取浸渍，获取假高梁及近缘种植物的种子浸渍液，再检测特定敏感波段上的紫外吸光度值，应用计算机软件生成假高粱及其需要鉴定的目标物种的聚类分析图，进而分析鉴别，将假高粱与其近缘物种区分开，以鉴定目标物种。鉴定方法简单，结果可靠，成本低，可避免因鉴定错误造成的损失，在植物检疫检验中有重要意义。
文档编号G01N21/33GK102650594SQ20121015976
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者印丽萍, 娄玉霞, 郭水良 申请人:上海师范大学