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专利名称：金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法
技术领域：
金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
有机磷农药主要用作农业杀虫剂，少数品种用作杀菌剂、除草剂和脱叶剂。本类农药杀虫效果好，残效期较短，但对温血动物具有一定毒性，毒性与化学结构有关。多数属于中等毒和低毒，少数属于高毒类。有机磷农药通式如下
R ηO(S)
1 \ /
八
R2Ox ^ (OX或 SX)上式中R1和R2多数为甲基和乙基，X为烷氧基、芳香基、卤素或杂环取代基团。有机磷农药可以和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)活性中心丝氨酸上的羟基结合，抑制AChE的活性，使AChE失去对乙酰胆碱的水解能力，造成组织中乙酰胆碱的积聚，引起胆碱能受体活性紊乱，这会引起呼吸麻痹甚至死亡。有机磷农药在工农业生产中广泛应用，但农药的长期大量使用所带来的农药残留问题却成为影响人类健康与环境安全的重大隐患。2010年1月25日至2月5日，武汉市农业局在抽检中发现来自海南省的5个豇豆样品水胺硫磷农药残留超标，消息一出，全国震惊。随后，国内多个城市发现海南“毒豇豆”， 查出的“毒豇豆”是有机磷农药中的水胺硫磷、甲胺磷、三唑磷等超标，这些高毒农药早已被我国农业部门禁止在蔬菜和水果上使用。2010年4月份，青岛又出现有机磷超标的“毒韭
^tC Ο目前，有机磷农药的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法 (GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测食品中的有机磷农药。国标中对蔬菜中甲胺磷的检出限量为O。

发明内容
本发明的目的是提供一种利用金纳米粒子的聚集和酶抑制的比色方法，以快速、 简单、灵敏的检测食品中有机磷农药的残留量。技术问题一种金纳米粒子的聚集和酶抑制的比色法检测食品中有机磷农药的残留量的方法，利用乙酰胆碱酯酶催化底物碘化乙酰硫代胆碱水解得到硫代胆碱，硫代胆碱能使金纳米粒子发生聚集，体系由酒红色变为灰色，并且金纳米粒子的特征吸收峰发生红移，当有机磷农药作用于乙酰胆碱酯酶时，会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，因而可以通过金纳米粒子聚集程度的减少来检测体系中的有机磷。本发明的技术方案包括以下步骤金纳米粒子(AuNPS)的制备；分别对金纳米粒子，金纳米粒子、底物和酶体系进行透射电镜表征；运用金纳米粒子聚集和酶抑制的比色方法检测有机磷农药并进行实际样品的检测。(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0. 45 μ m的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38. 8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0. 45 μ m的微孔膜过滤，4°C保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。(2)检测甲胺磷所用体系的制备在四个试管(1.5mL)中都分别依次加入金纳米粒子180 μ L，娃哈哈纯净水 720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，IOmM, ρΗ = 8. 0) 100 μ L。(3)金纳米粒子的聚集和酶抑制的比色法检测甲胺磷向制备好的检测甲胺磷的体系中分别加入不同浓度的甲胺磷溶液标准品，再迅速加500mU的AChE 10 μ L，由于甲胺磷抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得金纳米粒子团聚的程度不同，即由红色变为灰色的程度不同。所用甲胺磷标准品浓度依次为0. 0,0. 02,0. 05,0. 20,1. 00,1. 42 μ g/mL,添加到金纳米粒子体系中，并对金纳米粒子的特征等离子共振峰进行测定，金纳米粒子的等离子共振峰由522nm红移至675nm，且甲胺磷浓度越高，522nm(A522)处的吸收值越大，根据 A522与甲胺磷的浓度建立标准曲线。本发明中，甲胺磷的检出限为1.40ng/mL，线性范围为 0. 02μ g/mL-1. 42 μ g/mL。(4)实际样品检测取卷心菜进行实际样品检测。取IOg卷心菜，将其切碎，并和 50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次， 过滤液用IOmL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到 0. 5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的甲胺磷标准品。本发明的有益效果本发明制备了一种金纳米粒子，并建立了一个可简单、快速、 灵敏的检 测食品中有机磷农药的方法，为今后的监管提供了方便。


图1透射电镜图㈧金纳米粒子；(B)含有碘化乙酰硫代胆碱(15μΜ，ρΗ 8. 0PBS)和乙酰胆碱酯酶(500mU/mL)的金纳米粒子；A中插图为标尺为20nm时金纳米粒子的透射电镜图。图2体系(金纳米粒子180 μ L，娃哈哈纯净水720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，IOmM,ρΗ = 8. 0) 100 μ L)，不同浓度的乙酰胆碱酯酶10 μ L)的吸光度值A522随时间的变化，曲线从下往上乙酰胆碱酯酶的浓度分别为0，100，200，350，500mU/ mL ；插图为体系在25°C下反应20min后的照片。
图3含有不同浓度甲胺磷(0，0. 02，0.05，0.20，1.00，1.42 μ g/mL)体系的吸收光谱图；插图为甲胺磷的标准曲线和体系的照片。表1样品的加标回收率。
具体实施例方式金 纳米粒子AuNPs的制备材料/试剂氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。方法所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0. 45 μ m的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38. 8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用 0. 45 μ m的微孔膜过滤，4°C保藏。结果经透射电镜表征，所制得的金纳米粒子粒径为13nm，且分散性良好，粒径均勻。由于实验所用的体系受到酶浓度和反应时间的影响，所以需要研究反应体系酶浓度和反应时间变化对比色反应的影响。材料/试剂13nm的金纳米粒子；碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶(500U/mg) 购自 Sigma-Aldrich。方法在四个相同体系(金纳米粒子180 μ L，娃哈哈纯净水720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，IOmM, ρΗ = 8. 0) 100 μ L)中加入不同浓度的乙酰胆碱酯酶(0_500mU/mL)，于25°C反应不同时间，优化出最适酶浓度及反应时间。结果结果表明，最适酶浓为500mU，最适反应时间为30min。金纳米粒子用于甲胺磷检测材料/试剂13nm的金纳米粒子；碘化乙酰硫代胆碱，乙酰胆碱酯酶(500U/mg)和甲胺磷标准品购自Sigma-Aldrich ；有机蔬菜(卷心菜)购自于当地市场。方法(1)金纳米粒子的聚集和酶抑制的比色法检测甲胺磷向制备好的检测甲胺磷的体系中分别加入不同浓度的甲胺磷溶液标准品，再迅速加500mU的AChE IOyL,由于甲胺磷抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得金纳米粒子团聚的程度不同，即由红色变为灰色的程度不同。(2)所用甲胺磷标准品浓度依次为0. 0,0. 02,0. 05,0. 20、1. 00、1. 42 μ g/mL，添加到金纳米粒子体系中，并对金纳米粒子的特征等离子共振峰进行测定。(3)实际样品检测取卷心菜进行实际样品检测。取IOg卷心菜，将其切碎，并和 50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次， 过滤液用IOmL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0. 5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中， 如权利6所述，加入不同浓度的甲胺磷标准品。W039]结果金纳米粒子的等离子共振峰由522nm红移至675nm，且甲胺磷浓度越高，522nm(A522)处的吸收值越大，根据A522与甲胺磷的浓度建立标准曲线。本发明中，甲胺磷的检出限为1.40ng/mL，线性范围为0.02yg/mL-1. 42 μ g /mL。
权利要求
1.一种金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，其特征在于利用金纳米粒子的聚集和酶抑制的比色方法检测食品中有机磷农药的残留量，包括以下步骤金纳米粒子(AuNPS)的制备；观察金纳米粒子、底物和酶体系的比色反应，并测定紫外-可见吸收光谱；分别对金纳米粒子，金纳米粒子、底物和酶体系进行透射电镜表征；运用金纳米粒子聚集和酶抑制的比色方法检测有机磷农药并进行实际样品的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述金纳米粒子(AuNPS)的制备步骤如下所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过 0. 45 μ m的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38. 8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0. 45 μ m的微孔膜过滤，4°C保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述观察金纳米粒子、底物和酶体系的比色反应的步骤如下在四个试管(2. OmL)中分别依次加入13nm的金纳米粒子180yL，娃哈哈纯净水 720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，IOmM, ρΗ = 8. 0) 100 μ L，再依次加入不同浓度的 AChE (a, OmU/mL ；b, 100mU/mL ；c, 200mU/mL ；d, 350mU/mL ；e, 500mU/ mL) 10 μ L，然后将混合物在25°C下培养5min，观察颜色变化。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述测定紫外_可见吸收光谱的步骤如下在四个试管(2. OmL)中分别依次加入13nm的金纳米粒子180yL，娃哈哈纯净水 720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的PBS (10mM，ρΗ = 8. 0) 100 μ L，再依次加入不同浓度的 AChE (a, 0mU/mL ；b, 100mU/mL ；c, 200mU/mL ；d, 350mU/mL ；e, 500mU/mL) 10 μ L,然后将混合物在25°C下培养一定时间(min)，在碘化乙酰硫代胆碱水解的过程中(O-SOmin)，每隔两分钟测定一次紫外_可见吸收光谱。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述透射电镜表征的步骤如下①样品制备吸取13nm金纳米粒子180 μ L，娃哈哈纯净水720 μ L，含有15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的 PBS(10mM,pH = 8. 0) 100 μ L，500mU/mL的乙酰胆碱酯酶10 μ L于2mL离心管中，作为对照， 另一离心管中不加底物和乙酰胆碱酯酶，在25°C下同时培养IOmin ；将两种样品分别滴于两个铜网上，室温晾干备用；②参数用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述比色方法检测有机磷农药的步骤如下以甲胺磷为有机磷农药的代表用比色方法检测向含有180 μ L13nm金纳米粒子，720 μ L娃哈哈纯净水和100 μ L 15 μ M碘化乙酰硫代胆碱的PBS(10mM，ρΗ = 8. 0)的体系中，分别加入不同浓度的甲胺磷溶液标准品和10 μ L 500mU/mL的乙酰胆碱酯酶，金纳米粒子的聚集程度将随着农药浓度的不同而不同；根据A522与甲胺磷的浓度建立标准曲线，甲胺磷的检出限为1.40ng/mL，线性范围为 0. 02μ g/mL-1. 42μ g/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述实际样品的检测是取卷心菜为蔬菜的代表进行的。取 IOg卷心菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用IOmL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0. 5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解， 定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的甲胺磷标准品。
全文摘要
本发明涉及一种金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，属于分析化学技术领域。检测步骤包括金纳米粒子(AuNPs)的制备；建立检测有机磷农药的方法；实际样品检测等步骤。本发明根据金纳米粒子体系的颜色变化，可简单、快速、灵敏的检测有机磷农药中的甲胺磷，并且有很高的灵敏度，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
文档编号G01N21/33GK102221529SQ20111007973
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘吕睿, 孙春燕, 平红, 张民伟, 李宏坤, 郭佳佳 申请人:吉林大学