专利名称：检测Galectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种时间分辨免疫荧光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)检测方法，具体为应用时间分辨免疫荧光方法检测样品中的 Galectin-3蛋白的浓度。人外周血中(ialectin-3蛋白浓度的增加与胰腺癌的发生发展存在密切关联，运用本试剂盒能够对胰腺癌的发生发展起到诊断作用。
背景技术：
(ialectin-3是β -半乳糖苷结合蛋白，属lectin家族成员，它具有CRD结构域， 与含β-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂具有很高的亲和力，在细胞与细胞、细胞与基质之间起到特异性粘附作用，与肿瘤的转移、浸润、生长和粘附密切相关。我们运用MALDI-T0F-MS质谱技术发现(ialectin-3在人胰腺癌组织中呈现高表达[1]，并且它的表达水平与胰腺癌的分期及预后相关。我们的研究发现，正常人、胰腺癌和其它消化系统肿瘤外周血清中均未检测出feilectin-3蛋白，而胰腺癌患者外周血清中的feilectin-3阳性率高达为30% β]。因此，Galectin-3对胰腺癌具有明确的诊断价值。时间分辨免疫荧光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)检测方法是一种成熟的免疫分析方法，具有高特异、高灵敏的优点，是在临床医学和检验医学等诸多方面得到十分广泛的应用，是目前取代放射性免疫分析的一种定量检测方法。它的基本原理是利用三价稀土离子(如Eu3+)作为示踪物，延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰，即测定复合物中的稀土离子被激发的延迟荧光强度，从而确定待测蛋白的浓度。使用荧光增强液的TRF能够检测到皮克(pg，10 — 12g/ml)水平的蛋白，因此， 本试剂盒采用TRF的方法来检测(ialectin-3的浓度，是考虑了多方面的优点。目前，国际上还没有报道专门用于检测(ialectin-3的时间分辨免疫荧光方法，也没有相应的试剂盒提供，因此，该试剂盒的开发和应用，是填补了这方面的空白。参考文献
1.Jian-Hua Chen, Run-Zhou Ni ☆ , Ming-Bing Xiao, et al. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in human pancreatic cancer tissue. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2009 Apr;8(2):193-200. (☆ :Corresponding author)
2.葛飞，倪润洲☆，肖明兵，江枫，陆翠华，李立人，朱净，李小彦，刘肇修。血清 (ialectin-3对胰腺癌诊断价值的初探。《南通大学学报(医学版)》，2010,30 (1):32 — 3
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、特异的检测样本中(ialectin-3蛋白浓度的试剂盒及其制备方法。本发明的目的是通过以下方法实现的在酶标板中用包被抗体(单克隆小鼠抗人Galectin-3抗体)包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体(生物素化的羊抗人 (ialectin-3多抗)孵育，再次洗板后加入Eu3 +标记的链亲和霉素孵育，然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值； 通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的(ialectin-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。本发明检测(ialectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其包括以下组成
(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；
(2)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(3)洗涤液为含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 缓冲液(TBS)，其成分为 SOmMmiTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(5)荧光增强液(EnhancementSolution)；
(6)检测缓冲液(AssayBuffer)为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
(7)包被抗体为单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)，储存浓度为 1 μ g/ μ 1 ；
(8)检测抗体为生物素化的羊抗人feilectin-3多抗(BiotinylatedAnti-Human Galectin-3 Antibody)，储存浓度为 50ng/ μ 1 ；
(9)Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，储存浓度为0. 1 μ g/ μ 1 ；
(10)标准品，重组人Galectin-3 蛋白(Recombinant Human Galectin-3)，浓度为 100 μ g/μ 1。
本发明检测felectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用步骤如下
(1)用PBS稀释包被抗体一单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；
(2)弃去包被抗体，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀释好的检测抗体，37°C孵育lh；
(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；
(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次
(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动5min ；
(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；
(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的(ialectin-3的浓度。
本试剂盒采用时间分辨免疫荧光方法来检测样品中的felectin-3蛋白浓度，其中应用了双抗体夹心法，利用包被抗体一单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(Monoclonal Anti-Human Galectin-3 Antibody)来捕获样品中微量的feilectin-3蛋白，然后用生物素 it^i^-iKA Galectin-3 (Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody) 捕获的(ialectin-3蛋白结合，由于生物素与链亲和霉素能够高亲和力结合，我们用Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3 + -labeled streptavidin)来与生物素化的羊抗人feilectin-3多抗结合，形成三明治样复合结构，样品中的(ialectin-3就被Eu3+标记上并固定在酶标板中， 最后应用337nm波长的激发光激发，在发射光波长(Emission wavelength)为615nm处，测定荧光值；然后根据标准曲线来计算(Galectin-3的浓度。应用时间分辨免疫荧光法来高灵敏、高特异地检测外周血中的felectin-3浓度是该试剂盒的一个最显著特色和创新。
本发明还具有良好的稳定性，操作时间短，成本低。
图1为检测(ialectin-3蛋白浓度的检测标准曲线。
具体实施例方式本发明中的一些术语与缩写TRF:时间分辨免疫荧光；BSA:牛血清白蛋白； Tween-20 吐温20 ；Tween-40 吐温40 ；PBS 磷酸盐缓冲液；TBS =Tris-HCl 缓冲液；bovine globulin 牛球蛋白；DTPA 二乙烯三胺五乙酸。试剂配方
1.缓冲液
包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；
洗涤液为含0. 05%Tween-20的iTris-HCl缓冲液(TBS)，其成分为50mM的iTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ； 加样缓冲液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ；
检测缓冲液为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7. 8)，其中含有1%BSA, l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
2.标准品蛋白
商品化的重组人feilectin-3蛋白(R&D公司产品)4.酶标板
Nunc八联孔酶标条
本发明运用时间分辨免疫荧光方法来检测样品中的felectin-3蛋白浓度，其试剂盒的使用步骤如下
(1)用PBS稀释包被抗体一单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；
(2)弃去包被抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀释好的检测抗体，37°C孵育lh；
(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；
(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次
(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动 5min ；
(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；
(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的(ialectin-3的浓度。
权利要求
1.检测feilectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于包括以下组成(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；(2)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(3)洗涤液为含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 缓冲液(TBS)，其成分为 50mM 的 iTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(5)荧光增强液(EnhancementSolution)；(6)检测缓冲液(AssayBuffer)为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；(7)包被抗体为单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)，储存浓度为 1 μ g/ μ 1 ；(8)检测抗体为生物素化的羊抗人feilectin-3多抗(BiotinylatedAnti-Human Galectin-3 Antibody)，储存浓度为 50ng/ μ 1 ；(9)Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，储存浓度为0. 1 μ g/ μ 1 ；(10)标准品，重组人Galectin-3 蛋白(Recombinant Human Galectin-3)，浓度为 100 μ g/μ 1。
2.如权利要求1所述检测felectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤(1)用PBS稀释包被抗体一单克隆小鼠抗人feilectin-3抗体(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；(2)弃去包被抗体，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(3)弃去封闭液，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至浓度为75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀释好的检测抗体，37°C孵育lh；(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动 5min ；(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的(ialectin-3的浓度。
全文摘要
检测Galectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒。试剂盒包括包被缓冲液；封闭液；洗涤液；加样缓冲液；荧光增强液；检测缓冲液；包被抗体(单克隆小鼠抗人Galectin-3抗体)；检测抗体(生物素化的羊抗人Galectin-3多抗)；Eu3＋标记的链亲和霉素；标准品(重组人Galectin-3蛋白)。其使用包括该试剂盒采用双抗体夹心法和时间分辨免疫荧光原理来检测样品中的Galectin-3蛋白的浓度。在酶标板中包被抗体包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体孵育，再次洗板后加入Eu3＋标记的链亲和霉素孵育，然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的Galectin-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。
文档编号G01N33/577GK102226809SQ201110036899
公开日2011年10月26日 申请日期2011年2月13日 优先权日2011年2月13日
发明者倪润洲, 倪温慨, 肖明兵 申请人:倪润洲, 倪温慨, 肖明兵
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