专利名称：一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法的制作方法
一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种测定罗氟司特原料及其杂质的方法，特别涉及一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法。
背景技术：
罗氟司特(Roflumilast)，化学名为3_环丙基甲氧基_N_(3，5_ 二氯吡 P定-4-基)-4- 二氟甲氧基苯甲酸胺(3_cyclopropyImethoxy-N- (3, 5-dichloropydin-4-yl )-4- (difluoromethoxy)benzamide),是德国 Altana 公司开发的憐酸二酯酶 4(PDE4)抑制剂，2010年7月经欧盟批准首次于德国上市，临床用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)，商品名 Daxas，2011年3月经美国FDA批准上市。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种严重的致残、致死性疾�。言斐沙林氐纳缁峋酶旱＃酒吠ü种芓OE4减少炎症介质的释放，进而抑制如COPD和哮喘等呼吸道疾病对肺组织造成的损伤[韩伟，周新.慢性阻塞性肺疾病的治疗新选择——罗氟司特.《世界临床药物》2011，32 (7):396-399 ;马培奇.慢性阻塞性肺病治疗新药罗氟司特.《上海医药》2011，32 (4) 201-202;封宇飞.磷酸二酯酶_4抑制剂罗氟司特的药理与临床研究新进展·《中国新药杂志》2011，20 (14)1257-1260, 1265 页]。因此，合成罗氟司特原料，制成相应的制剂具有重大的医学意义。
目前，国内对罗氟司特含量和有关物质的测定方法未见报道，国外对罗氟司特含量和有关物质的测定主要是高效液相色谱法[V. D. Barhate and P. C. Deosthalee. Validation of Rapid liquid Chromatographic Method for the Determination of Roflumilast. J. Chem. Pharm. Res. , 2011,3(2): 770-775 ；V. D. Barhate and P. C. Deosthalee. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010,72 (3)，401-404.], 其色谱条件如下色谱柱为Z0RBAX，SB-C18, 1.8ym, 50mmX4. 6mm(ID);流动相采用的是乙腈和甲酸铵缓冲盐(PH3. 5)梯度洗脱程序，其中流动相比例变化为5个；流速为0. 5 mL/min ;柱温25°C;检测波长为UV210nm ;进样量为3 μ I。但其所用液相方法分离的杂质不多，而色谱条件却较苛刻，不利于一般实验室或药厂推广应用。发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过大量试验对罗氟司特原料及制剂的分析方法进行研究，从而提供一种测定罗氟司特原料及其杂质含量、罗氟司特制剂及其有关物质含量、罗氟司特制剂溶出度的反向高效液相色谱法。
本发明的目的是这样实现的
一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其中反向高效液相色谱采用的流动相采用极性有机溶剂、水、冰乙酸体积比为40-60 40-60 0. 05-0. 5的混合液。
优选地，所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其中反向高效液相色谱采用的流动相采用极性有机溶剂、水、冰乙酸体积比为52 48 0. I的混合液。
进一步优选地，所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其中所述极性有机溶剂为甲醇或/和乙腈。
进一步优选地，所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其中所述极性有机溶剂为乙腈。
再进一步优选地，所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法， 其中反向高效液相色谱条件为
色谱柱Z0RBAX,SB-C18, 5 μ m, 250X4. 6mm (ID);
流动相乙腈7jC :冰乙酸=52:48:0. I ；
流速:1·OmL/min ；
柱温40°C;
检测波长UV210nm;
进样量20-100μ I。
与现有技术相比，本发明涉及的反向高效液相色谱法具有如下优点和显著的进步简便快捷，灵敏度高，准确性好。经试验，相关系数均在O. 999以上。样品检测专一性强，各项方法学指标均可满足罗氟司特原料或制剂的检测需要。
图I为罗氟司特各中间体及其混合物的色谱分离图。
图I A中a为4-氨基-3，5-二氯吡啶；b为罗氟司特氮氧化物；(为3-环丙基甲氧基_ 二氟甲氧基苯甲酸；d为3-环丙基甲氧基-二氟甲氧基苯甲醛；e为罗氟司特。
图I B为色谱分离的3D图。
图2为罗氟司特及各中间体低浓度标准曲线图；其中A为4-氨基-3，5- 二氯吡啶，B为罗氟司特氮氧化物，C为3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸，D为3-环丙基甲氧基-4- 二氟甲氧基苯甲醛，E为罗氟司特。
图3为罗氟司特含量测定标准曲线图。
图4为罗氟司特在不同介质中的溶出标准曲线图；其中A为O. lmol/L盐酸，B为水，C为pH4. 5醋酸盐缓冲液，D为pH6. 8磷酸盐缓冲液。
具体实施方式
罗氟司特已被开发上市的剂型只有片剂，本发明所用的罗氟司特也是作为罗氟司特片剂的原料。本发明所用的分析方法对罗氟司特原料和制剂的含量和有关物质均能获得满意的分析结果，满足分析方法的各项验证结果。具体地，根据不同的测定目的，本发明所述高效液相色谱法的色谱条件如下
(I)罗氟司特原料及其杂质的高效液相色谱法
色谱柱Z0RBAX,SB-C18, 5 μ m, 250X4. 6mm (ID);
流动相乙腈7jC :冰乙酸=52:48:0. I ；
流速1·Oml/min ；
柱温40°C;
检测波长uv21Onm ；
进样量20μ I。
(2)罗氟司特制剂含量和有关物质的反相高效液相色谱法
色谱柱Z0RBAX,SB-C18, 5 μ m, 250X4. 6mm (ID);
流动相乙腈7jC :冰乙酸=52:48:0. I ；
流速1·Oml/min ；
柱温40°C;
检测波长uv21Onm ；
进样量20μ I。
(3)罗氟司特制剂溶出度的高效液相色谱法，溶出介质为O. 1%的月桂醚，色谱条件为
色谱柱ZORBAX,SB-C18, 5 μ m, 250X4. 6mm (ID);
流动相乙腈7jC :冰乙酸=52:48:0. I ；
流速1·Oml/min ；
柱温40°C；
检测波长uv21Onm ；
进样量100μ I。
本发明实施例所采用的实验仪器如下
岛津高效液相色谱仪，配备LC-20AT，SH)-M20A。色谱分离系统的控制和记录有 LCSolution 15C色谱工作站完成。色谱柱选用的是Zorbax SB C18 (安捷伦公司)5 μ m， 250 X 4. 6mm (ID)。
本发明实施例所采用的试剂与药品如下
罗氟司特片剂市售品由公司提供(Forest res inst inc公司)，罗氟司特原料为自制，经过结构确认；罗氟司特氮氧化物(N- (3，5- 二氯吡啶-4-基)-3-环丙基甲氧基-4- 二氟甲氧基本甲酰胺)由剀试上�？萍加邢薰咎峁�4_氨基-3，5- 二氯吡啶，罗氟司特中间体B (3-(环丙基甲氧基)-4- (二氟甲氧基)苯甲酸)，罗氟司特中间体B前体 (3-(环丙基甲氧基)-4- (二氟甲氧基)苯甲醛)均由无锡药兴医药科技有限公司提供。所有的对照品均经过紫外(UV)，红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(NMR)表征，甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自霍尼韦尔(上海)有限公司。实验中用水为双蒸水。
以下通过实施例形式，对本发明涉及的测定罗氟司特原料及其杂质含量、罗氟司特制剂及其有关物质含量、罗氟司特制剂溶出度的反向高效液相色谱法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例I罗氟司特原料含量和有关物质色谱条件的选择
( I)流动相
本实验比较了四个不同的流动相乙腈水=60:40、乙腈水=55:45、乙腈水 =52 :48、乙腈7jC :冰乙酸=52 48:0. I，结果表明乙腈冰:冰乙酸=52 48:0. I分离最好。
(2)专属性考察
本实验分别在强酸，强碱，氧化，高温，光照条件下破坏后进样分析，结果各破坏条5件下生成的杂质峰均能与主成分峰分离良好。
(3)系统适用性实验
本实验分别用罗氟司特起始物料A，罗氟司特起始物料B，罗氟司特起始物料B前体，罗氟司特的氮氧化物及其混合物来分析此色谱条件是否符合要求(见图I)。由图I可见，此条件下各个杂质与主峰以及杂质之间分离度符合要求。
实施例2罗氟司特及各中间体低浓度标准曲线
取罗氟司特合成中间体B 3_(环丙基甲氧基)-4_( 二氟甲氧基)苯甲酸、中间体 B前体即3-(环丙基甲氧基)-4- ( 二氟甲氧基)苯甲醛，4-氨基-3，5- 二氯吡啶，罗氟司特氮氧化物、罗氟司特适量，精密称定，加流动相溶解并制成各约O. 15mg/ml的溶液，分别精密量取1ml，置同一 IOOml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为母液。分别精密量取母液 l、3、4、5、6ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为各梯度浓度的供试液。分别精密量取20 μ 1，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度(μ g/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。结果见图2 (A- E)。
回归方程分别为
4-氨基-3，5- 二氯吡啶y = 137832x -168. 59，r=0. 9997
罗氟司特氮氧化物y= 114990x +886. 77，r=0. 9995
3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸y = 131304χ_289· 77，r=0. 9999
3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲醛y = 130449x + 92. 027，r=0. 9996
罗氟司特Y= 124797x + 707. 6, r=0. 9999
当信噪比S/N=3时，测得4-氨基-3，5_ 二氯吡啶的检测限为O. 02922 μ g/ml，罗氟司特氮氧化物的检测限为O. 03134 μ g/ml，3-环丙基甲氧基_4_ 二氟甲氧基苯甲酸的检测限为O. 03152 μ g/ml, 3-环丙基甲氧基_4_ 二氟甲氧基苯甲醒的检测限为O. 03014 μ g/ml, 罗氟司特的检测限为O. 02838 μ g/ml μ g/ml。
实施例3罗氟司特含量测定标准曲线
取罗氟司特对照品适量，精密称定，加流动相配制成含罗氟司特O. 3mg/ml的溶液，作为母液；分别精密量取l、3、5、7、9ml，置IOml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为各浓度梯度的供试液。分别精密量取20 μ 1，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度(mg/ml) 为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。结果见图3，回归方程为y =I X IO8X -44750，相关系数为 O. 9999。
实施例4罗氟司特制剂含量和有关物质色谱条件的选择
(I)参考罗氟司特原料含量和有关物质的色谱条件，主要考察了辅料的干扰性，结果是空白辅料不影响本品的有关物质检查。
(2)专属性实验
本实验罗氟司特制剂分别在强酸，强碱，氧化，高温，光照条件下破坏后进样分析， 结果各破坏条件下生成的杂质峰均能与主成分峰分离良好。辅料出峰均在3 min以前，并且本品强降解峰均位于3 min之后。
实施例5罗氟司特溶出度的测定
(I)溶出介质的选择
由于本品难溶于水，本实验分别考察了 1%SDS、3%SDS、3%吐温80、3%和1%聚氧乙烯月桂醚5种不同溶剂中罗氟司特的溶出率，结果表明，聚氧乙烯月桂醚存在时罗氟司特的溶出率相比于SDS、吐温80药高，因此选择含O. 1%聚氧乙烯月桂醚的水溶液、O. lmol/L 盐酸溶液、PH4. 5的醋酸盐缓冲液和pH6. 8的磷酸盐缓冲液作为考察F2因子的溶出介质。
(2)溶出标准曲线
取罗氟斯特对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每Iml约含罗氟斯特O. Img的溶液，分别精密量取对照液I. Oml于IOOml量瓶中，加O. lmol/L盐酸、水、pH4. 5醋酸盐缓冲液、pH6. 8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，作为各介质项下的母液；分别精密量取各介质项下的母液l、3、5、7、9ml，置IOml量瓶中，以相应介质稀释至刻度，摇匀，作为各介质项下的梯度浓度供试液。照溶出度测定法，进样量100 μ 1，测定210nm波长下峰面积，以浓度(μ g/ ml)作为横坐标，峰面积(A)作为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数，结果见图4 (A-D)0
O. lmol/L 盐酸回归方程为 Y=666779x+2333. 2，r=0. 9999
水:回归方程为 Y=679490x+3991. 3，r=0. 9994
ρΗ4· 5醋酸盐缓冲液回归方程为Υ=637974χ+1067. 7，r=0.9994
ρΗ6· 8磷酸盐缓冲液回归方程为Y=678258x+1619. I，r=0.9994
实施例6样品测定
(I)液相测定罗氟司特原料样品含量
取3批号样品适量(约含罗氟司特15mg)，精密称定，置IOOml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试液；另取对照品适量，同法配制成罗氟司特浓度约为 O. 15mg/ml，作为对照液。分别量取供试及对照溶液20μ 1，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即得。
(2)罗氟司特原料有关物质含量测定
取3批号样品含量测定项下的供试液，作为供试液；取对照品适量，精密称定，加流动相稀释制成约含罗氟司特I. 5 μ g/ml的溶液，作为对照液I ;另取对照液1，用流动相稀释10倍，作为对照液2。分别量取供试液、对照溶液及流动相20μ 1，注入色谱仪，记录色谱图，供试品色谱图上，除去流动相色谱图中相应位置的色谱峰，按外标法以对照液2的主峰面积计算单个杂质，并将杂质峰面积之和与对照液I的主峰面积比较，计算总杂质。
样品中组成份及有关物质检测结果见表I。
表I罗氟司特原料检测结果
权利要求
1.一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其特征在于反向高效液相色谱采用的流动相采用极性有机溶剂、水、冰乙酸体积比为40-60 :40-60 :0. 05-0. 5的混合液。
2.根据权利要求I所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其特征在于反向高效液相色谱采用的流动相采用极性有机溶剂、水、冰乙酸体积比为52 48 O.I的混合液。
3.根据权利要求I或2所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其特征在于所述极性有机溶剂为甲醇或/和乙腈。
4.根据权利要求I或2所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其特征在于所述极性有机溶剂为乙腈。
5.根据权利要求I或2所述测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其特征在于反向高效液相色谱条件为 色谱柱ZORBAX, SB-C18, 5 μ m, 250X4. 6mm ； 流动相乙腈冰冰乙酸=52:48:0. I ； 流速1. OmL/min ； 柱温40°C ； 检测波长UV210nm ； 进样量20-100 μ I。
全文摘要
本发明公开了一种测定罗氟司特原料及其杂质含量的反向高效液相色谱法，其中反向高效液相色谱采用的流动相采用极性有机溶剂、水、冰乙酸体积比为40-6040-600.05-0.5的混合液。本发明涉及的反向高效液相色谱法简便快捷，灵敏度高，准确性好，样品检测专一性强，各项方法学指标均可满足罗氟司特原料或制剂的检测需要。
文档编号G01N30/89GK102928546SQ201210453639
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者王雪根, 何凌云, 何凤琴, 罗晶, 周磊, 秦妮, 纪慧敏 申请人:南京艾德凯腾生物医药有限责任公司
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