葡萄糖异构酶突变体及其应用的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：葡萄糖异构酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及高活力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶突变体、在测定果糖方面的应用和所使用的试剂盒。
背景技术：
精液中的果糖由精囊腺分泌，是供精子代谢活动的重要营养成分。因此，果糖含量高低直接影响精子的活力。临床上精液果糖测定主要用于精囊、输精管、前列腺疾病的诊断和鉴别诊断以及不孕症的诊断。近年来发现，精囊分泌果糖的功能受雄激素的调控，故精液的果糖含量可反映体内雄激素水平的变化，精液果糖测定可用于男性性腺分泌功能及性功能的评价及相关疾病的诊断。
尽管精液果糖测定在临床上具有多方面的重要价值，但由于检测方法的限制，临床实验室并未广泛开展精液果糖分析。目前测定精液果糖的方法主要有色谱法、化学法及果糖脱氢酶法。色谱法受仪器的限制，因临床实验室很少拥有高效液相色谱仪，也缺乏有关技术。化学法利用果糖和间苯二酚、吲哚或咔唑等化合物反应生成颜色变化，通过比色求得含量，但这些化学显色反应都必须在强酸性介质和高温(80-100oC)中进行，操作中需加入高浓度的硫酸或盐酸，不安全，也不适合自动生化分析仪操作；而且显色产物不稳定，重复性很差，误差可高达100％。脱氢酶法是90年代发展的新方法，反应条件温和，结果准确，但果糖脱氢酶及其显色剂的化学性质不稳定，两者都需使用前新鲜配制，且酶试剂价格昂贵，因此其商业化应用也受到限制。因此可以说，到目前为止临床上还没有一种真正理想而实用的精液果糖测定方法。
葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，E.C.5.3.1.5，简称GI)催化葡萄糖产生果糖，也可以果糖为底物生成葡萄糖。现有的葡萄糖异构酶催化果糖产生葡萄糖的活力低，测定精液果糖的灵敏度相应也低，不敷临床检验精液果糖之用。因此，目前需要首先提供一系列耐高温、能高效率地将果糖转化为葡萄糖的葡萄糖异构酶，然后利用葡萄糖异构酶来高效、灵敏地检测果糖含量。

发明内容
本发明利用遗传工程和蛋白质工程技术对来源于Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum的葡萄糖异构酶进行改良，培育出了一系列耐高温、高效率将果糖转化为葡萄糖的葡萄糖异构酶。这些葡萄糖异构酶将精液中的果糖有效转化成葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶法测定生成的葡萄糖的数量，进而可以确定精液中果糖的含量。本发明的方法是项世界首创的新检测方法，克服了现有测定精液果糖方法的弊端，具有操作简便、结果准确、反应条件温和、成本低廉、试剂稳定以及便于商业操作等特点。本发明的葡萄糖异构酶突变体还可以用于人体内、或体内某一器官、或其它生物体、或商品中果糖含量的测定。
本发明的目的在于提供具有高效催化果糖为葡萄糖之活性、或具高效催化果糖为葡萄糖之活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。本发明还相应地提供了编码所述葡萄糖异构酶突变体的DNA和这些突变体用于测定果糖含量的应用。
具体而言，本发明包括如下方面一方面，本发明提供了一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中的序列2(SEQ ID NO.2)为参考序列，具有在第186位的突变和选自第139位、第182位、第187位和第299位的至少三个突变，所述第139位的色氨酸突变为赖氨酸(Lys)、或丝氨酸(Ser)、或半胱氨酸(Cys)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或天冬酰胺(Asn)、或苯丙氨酸(Phe)，所述第182位的精氨酸突变为脯氨酸(Pro)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或缬氨酸(Val)，所述第186位的缬氨酸突变为苏氨酸(Thr)、或丙氨酸(Ala)、或天门冬氨酸(Asp)，所述第187位的苯丙氨酸突变为甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或脯氨酸(Pro)，以及所述第299位的苏氨酸突变为异亮氨酸(Ile)、或酪氨酸(Tyr)、或半胱氨酸(Cys)、或蛋氨酸(Met)、或谷氨酸(Glu)、或谷氨酰胺(Gln)。优选的是，本发明的葡萄糖异构酶突变体具有序列4(SEQ ID NO.4)所列的氨基酸序列，其中第139位的X代表苯丙氨酸(Phe)、第182位的X代表丙氨酸(Ala)、第186位的X代表苏氨酸(Thr)，第187位的X代表苯丙氨酸，同时第299位的X代表谷氨酰胺(Gln)。
另一方面，本发明提供了含有编码本发明所述的葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列的DNA。
再一方面，提供了将本发明葡萄糖异构酶突变体应用于测定果糖含量。使用本发明所述的高催化活性的葡萄糖异构酶突变体可以测定人体体液、或体内某一器官的果糖含量。在测定人体精液的果糖含量时，本发明的葡萄糖异构酶突变体特别有用。
又一方面，本发明提供一种测定人精液中果糖含量的方法，包括如下步骤1)获取人精液样品；2)将本发明所述的葡萄糖异构酶突变体加入到精液样品中，获得反应混合物；3)将反应混合物在65-80℃反应20-40分钟，优选在75℃下反应30分钟；和4)测得反应结束后的反应混合物中的果糖含量。
在进行步骤2)之前，还优选包括除去精液样品中的蛋白的步骤。该步骤的实施有许多方式，例如，可以通过将精液样品与离子交换树脂接触、或者通过向精液样品中加入蛋白变性剂使精液样品中的蛋白变性后再分离、或者通过将精液样品在90-100℃加热20-40分钟后再离心而实现。现有技术中有许多离子交换树脂可以使用，例如，Chelex 100。对于蛋白变性剂，也没有特别的限制。但是，出于对后续步骤的影响程度的角度考虑，优选使用那些易于从反应体系中除去的蛋白变性剂。
还一方面，本发明提供一种用于测定人精液中果糖含量的试剂盒，其特征在于包含本发明的葡萄糖异构酶突变体。优选的试剂盒还包括用于除去待测精液样品中的蛋白的试剂和葡萄糖氧化酶。在本发明的试剂盒中，其中所述用于除去待测精液样品中的蛋白的试剂可以是离子交换树脂，也可以是一般的蛋白变性剂。从易于处理和对后续步骤的影响程度的角度来看，使用离子交换树脂是较为优选的。为了提高测定的准确度，本发明试剂盒还可包括果糖浓度标准溶液。当然，标准溶液的功能也可以用计算机来实现。
附图表说明下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1葡萄糖异构酶突变体MGI-4B聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中从左至右的四条泳道依次为蛋白分子量标准、牛血清白蛋白、粗提蛋白、部分纯化的葡萄糖异构酶突变体MGI-4B。(粗提蛋白、部分纯化的葡萄糖异构酶突变体MGI-4B的制备见实例9)图2亲本葡萄糖异构酶与葡萄糖异构酶突变体在80℃的热稳定。其中MGI-4B代表具有四个突变位点的葡萄糖异构酶突变体，具体请参见实例13。
图3显示的是果糖含量测定标准曲线。
具体实施例方式本发明对Thermoanaerobacterium saccharolyticum葡萄糖异构酶基因进行定点突变，随后在MacConkey(DIFCO，USA)培养基上筛选葡萄糖异构酶克�。佣〉靡幌盗芯哂懈咝Т呋俏咸烟腔钚�、或具高效催化果糖为葡萄糖活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。如其中的一个突变体MGI-4B的比活性较亲本高755％。本发明中亲本基因系指来自Thermoanaerobacterium sachcharolyticum ATCC 49915的葡萄糖异构酶，其核苷酸序列如序列1(SEQ ID NO.1)所示，氨基酸序列为序列2(SEQ ID NO.2)所示。本发明中亲本基因的核苷酸序列与公布的T.saccharolyticum葡萄糖异构酶的基因序列(Lee et al.，Journal of GeneralMicrobiology，1391227-1234，1993；GenBank L09699)相比在第241-242位有不同，详见下文关于“亲本”的定义和实例1的描述。
在本发明制备葡萄糖异构酶的方法中，适用的载体包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy，pRSET和pET21；包括但不限于真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluescript-SK。
在本发明制备葡萄糖异构酶的方法中，适用的葡萄糖异构酶可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。
在本发明制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，所述载体的微生物宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核微生物包括但不限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌(如巨大芽胞杆菌BP931)、T.saccharolyticum和链霉菌(如Streptomyces diastaticus M1033)。所述真核微生物包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GS115/9891)。
本发明获得了一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中序列2(SEQID NO.2)所示氨基酸序列为参考序列，至少存在一个氨基酸的差异，并且以果糖为底物其具有比亲本至少高出50-150％、优选至少高出150-250％、更优选至少高出250％的葡萄糖异构酶催化活性。优选的是，以序列表中的序列2为参考序列，具有第186位的缬氨酸到其他19个天然氨基酸的突变和至少三个选自第139位的色氨酸到其他19个天然氨基酸、第182位的精氨酸到其他19个天然氨基酸、第187位的苯丙氨酸到其他19个天然氨基酸和第299位的苏氨酸到其他19个天然氨基酸的突变，并且以果糖为底物其具有比亲本高出至少50％的葡萄糖异构酶催化活性。更优选所述第139位的色氨酸突变为赖氨酸(Lys)、或丝氨酸(Ser)、或半胱氨酸(Cys)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或天冬酰胺(Asn)、或苯丙氨酸(Phe)；所述第182位的精氨酸突变为脯氨酸(Pro)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或缬氨酸(Val)；所述第186位的缬氨酸突变为苏氨酸(Thr)、或丙氨酸(Ala)、或天门冬氨酸(Asp)；所述第187位的苯丙氨酸突变为甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或脯氨酸(Pro)；和/或所述第299位的苏氨酸突变为异亮氨酸(Ile)、或酪氨酸(Tyr)、或半胱氨酸(Cys)、或蛋氨酸(Met)、或谷氨酸(Glu)、或谷氨酰胺(Gln)。最优选的是，本发明的葡萄糖异构酶突变体包含在第139、182、186和299位的突变。
这些突变体具有高效催化果糖为葡萄糖之活性、并具有耐热性。例如，在本发明获得的一系列突变体中，一个具有四个点突变的突变体MGI-4B的比活性较亲本高755％，且在80℃反应16小时后仍保持50％或以上的活力。
本发明获得的高催化活性或高催化活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体可用于测定人体内、或体内某一器官、或其它生物体、或商品中果糖含量。所述的葡萄糖异构酶突变体可以以未经纯化粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的形式。如果需要，还可利用本领域已知的固化技术将本发明葡萄糖异构酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。
本申请文本中所用的术语“亲本”系指来自Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum ATCC 49915的葡萄糖异构酶，其核苷酸序列如序列1所示，氨基酸序列如序列2所示。本发明中亲本基因的核苷酸序列与公布的T.saccharolyticum葡萄糖异构酶的基因序列(Lee et al.，Journal of GeneralMicrobiology，1391227-1234，1993；GenBank L09699)相比有两个核苷酸的差异，即与基因库(GenBank L09699)的核苷酸序列相比，本发明中亲本基因第241-242位为GC，相应的第81位氨基酸序列为丙氨酸(Ala)，GenBankL09699对应处、第241-242位核苷酸序列为CG，相应的第81位氨基酸序列为精氨酸(Arg)。
本申请文本中所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，系指序列表中的序列1，当其为氨基酸序列时，是指序列表中的序列2。在将参考序列和突变的葡萄糖异构酶序列进行排序比较时，可以手工进行，也可以用计算机进行(目前有许多可供利用的计算机软件，例如CLUSTALW，AMAS，DIALIGN程序等)。
本申请文本中所用的术语“葡萄糖异构酶突变体”是指这样一种以序列表中序列2所示氨基酸序列为参考序列，至少存在一个氨基酸的差异，并且以果糖为底物其具有比亲本高出至少50％的葡萄糖异构酶催化活性的酶。因此，在本专利申请中，所述葡萄糖异构酶突变体包括对序列2所示氨基酸序列中除第139、182、186、187和299位外的其他位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式。
实施例下列实施实例仅用于说明本发明而不应视作用于限定本发明的范围。实施实例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实例1亲本基因的扩增及其pGEMT-TS的构建根据基因库(GenBank L09699)基因序列设计引物T1和T2(见表1)。利用引物对T1和T2从T.saccharolyticum ATCC 49915(购自ATCC，USA)中扩增葡萄糖异构酶亲本基因。
扩增条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1，400nM引物T2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许T.saccharolyticum菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。
PCR扩增反应程序为95℃3分钟，40圈循环95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟。将扩增的产物(长约1.5kb)连接至载体pGEMT-Easy(Promega，USA)，得质粒pGEMT-TS。利用快速质粒制备试剂盒(MarligenBioscience，USA)提取质粒pGEMT-TS，经DNA测序确定亲本葡萄糖异构酶的核苷酸序列为序列表序列1，相应的氨基酸序列为序列表序列2。与基因库(GenBankL09699)的核苷酸序列相比，本发明中亲本基因第241-242位为GC，相应的第81位氨基酸序列为丙氨酸(Ala)。GenBankL09699对应处第241-242位核苷酸序列为CG，相应的第81位氨基酸序列为精氨酸(Arg)。
实例2葡萄糖异构酶位点139之定点突变定点突变技术参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCRProtocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
以质粒pGEMT-TS(见实例1)为模板，设计引物对139FF和139FR(见表1)，将亲本氨基酸序列中第139位点的Trp(W)突变为Phe(F)，获得突变体MGI-W139F。引物对T1和T2见实例1。
利用引物对T1和139FR，扩增T1FR片段，引物对139FF和T2，扩增FFT2片段。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM引物139FR或400nM引物139FF和400nM引物T2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction GelKit(QIAGEN，German)回收，得到T1FR片段和FFT2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM T2，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng T1FR片段与20ng FFT2片段，用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃ 30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel KitDNA回收试剂盒回收，得到全长突变基因MGI-W139F。将MGI-W139F与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-W139F。将质粒pGEMT-MGI-W139F转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-W139F DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。
按照类似步骤构建突变体MGI-W139K、MGI-W139S、MGI-W139C、MGI-W139I、MGI-W139T和MGI-W139N，所用引物见表1。
实例3葡萄糖异构酶位点182之定点突变定点突变技术主要参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCRProtocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
以质粒pGEMT-TS(见实例1)为模板，设计引物对182AF和182AR(见表1)，将亲本氨基酸序列中第182位点的Arg(R)突变为Ala(A)，获得突变体MGI-R182A。引物T1和T2见实例1。
利用引物对T1和182AR，扩增T1AR片段，引物对182AF和T2，扩增AFT2片段。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCI，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM引物182AR或400nM引物182AF和400nM引物T2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到T1AR片段和AFT2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nMT2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng T1AR片段与20ng AFT2片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因MGI-R182A。将MGI-R182A与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-R182A。将质粒pGEMT-MGI-R182A转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-R182ADNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。
按照类似步骤构建突变体MGI-R182P、MGI-R182S、MGI-R182I、MGI-R182T和MGI-R182V，所用引物见表1。
实例4葡萄糖异构酶位点186之定点突变定点突变技术参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCRProtocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
以质粒pGEMT-TS(见实例1)为模板，设计引物对186TF和186TR(见表1)，将亲本氨基酸序列中第186位点的Val(V)突变为Thr(T)，获得突变体MGI-V186T。引物T1和T2见实例1。
利用引物对T1和186TR，扩增T1TR片段，引物对186TF和T2，扩增TFT2片段。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM引物186TR或400nM引物T2和400nM引物186TF，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到T1TR片段和TFT2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nMT2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng T1TR片段与20ng TFT2片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因MGI-V186T。将MGI-V186T与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-V186T。将质粒pGEMT-MGI-V186T转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-V186TDNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。按照类似步骤构建突变体MGI-V186A和MGI-V186D，所用引物见表1。
实例5葡萄糖异构酶位点187之定点突变定点突变技术参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCRProtocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
以质粒pGEMT-TS(见实例1)为模板，设计引物对187SF和187SR(见表1)，将亲本氨基酸序列中第187位点的Phe(F)突变为Ser(S)，获得突变体MGI-F187S。引物T1和T2见实例1。
利用引物对T1和187SR，扩增T1SR片段，引物对187SF和T2，扩增SFT2片段。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物Tl和400nM引物187SR或400nM引物T2和400nM引物187SF，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到T1SR片段和SFT2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物Tl和400nMT2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng T1SR片段与20ng SFT2片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因MGI-F187S。将MGI-F187S与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-F 187S。将质粒pGEMT-MGI-F 187S转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-F187SDNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。按照类似步骤构建突变体MGI-F187G、MGI-F187P和MGI-F187A，所用引物见表1。
实例6葡萄糖异构酶位点299之定点突变定点突变技术参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCRProtocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
以质粒pGEMT-TS(见实例1)为模板，设计引物对299QF和299QR(见表1)，将亲本氨基酸序列中第299位点的Thr(T)突变为Gln(Q)，获得突变体MGI-T299Q。引物T1和T2见实例1。
利用引物对T1和299QR，扩增T1QR片段，引物对299QF和T2，扩增QFT2片段。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM引物299QR或400nM引物299QF和400nM引物T2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到TlQR片段和QFT2片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM T2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng T1QR片段与20ng QFT2片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因MGI-T299Q。将MGI-T299Q与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-T299Q。将质粒pGEMT-MGI-T299Q转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-T299QDNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。按照类似步骤构建突变体MGI-T299I、MGI-T299Y、MGI-T299C、MGI-T299M和MGI-T299E，所用引物见表1。
实例7葡萄糖异构酶四突变组合MGI-4B之构建定点突变技术参考Ho et al.(Gene 7751-59，1989)和White et al.(PCR Protocolcurrent methods and applications.Totowa，N.J.Humana Press，1993)之描述。
按实例2扩增和回收T1FR片段，按实例6扩增和回收QFT2片段。用引物对139FF(如实例2)和182AR(如实例3)扩增和回收FFAR片段。FFAR片段扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM139FF和400nM 182AR，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到FFAR片段。用引物对182AF(如实例3)和186TR(如实例4)扩增AFTR片段。AFTR片段扩增反应条件为20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM 182AF和400nM186TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到AFTR片段。用引物对186TF(如实例4)和299QR(如实例6)扩增TFQR片段。TFQR片段扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μMdGTP，400nM 186TF和400nM 299QR，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng pGEMT-TS，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick Extraction Gel Kit回收，得到TFQR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物T1和400nM T2，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng T1FR片段，20ng FFAR片段，20ng AFTR片段，20ng TFQR片段和20ng QFT2片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为95℃3分钟，35圈循环95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquickExtraction Gel Kit回收，得到全长突变基因MGI-4B。将MGI-4B与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MGI-4B。将质粒pGEMT-MGI-4B转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MGI-4B DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。MGI-4序列含有W139F、R182A、V186T和T299Q的四突变。MGI-4B序列见序列表序列5(SEQ ID NO.5)。
扩增亲本葡萄糖异构酶(亲本)与实例1-7葡萄糖异构酶突变体所用的引物如下表1所列
表1

实例8亲本葡萄糖异构酶的提取与纯化葡萄糖异构酶的提取与纯化主要参考Lee et al.，Journal of GeneralMicrobiology，1391227-1234(1993)。
将含亲本葡萄糖异构酶基因的质粒pGEMT-TS转化感受态细菌细胞HB101，在MacConkey平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上、37℃培养36小时。接种单个克隆在5ml LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养16小时。离心收集菌体，并悬浮于1ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17，800g，15分钟)并收集上清液，为粗提蛋白。粗提蛋白经80℃热处理10分钟后，离心(10℃，17，800g，15分钟)去沉淀。上清液即为部分纯化的葡萄糖异构酶，可用于酶活性的测定和测定精液果糖含量。
实例9葡萄糖异构酶突变体MGI-4B的提取与纯化葡萄糖异构酶突变体MGI-4B的提取与纯化与实例8同，惟所用质粒为pGEMT-MGI-4B。部分纯化的葡萄糖异构酶见图1。
实例10亲本葡萄糖异构酶活性的测定配底物溶液SA含1.0M的果糖、20mM磷酸钠缓冲溶液(pH6.5)、终浓度为250μM之CoCl2和终浓度为5mM之MgCl2调pH至6.5。取底物溶液SA90μl，然后加入10μl按实例8制备的葡萄糖异构酶，反应于80℃进行10分钟。将反应物置冰上以终止反应。反应产物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法测定(参见Trinder，Ann.Clin.Biochem，2427，1969，以及上�？苹�-东菱诊断用品有限公司的葡萄糖试剂盒使用说明书)。用CoomassiePlus Protein Assay Reagent Kit(PIERCE，USA)并结合SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔果糖为葡萄糖所需之酶量。
实例11葡萄糖异构酶突变体MGI-4B对果糖活性测定葡萄糖异构酶突变体MGI-4B活性测定与实例10同。结果显示葡萄糖异构酶突变体MGI-4B比亲本葡萄糖异构酶对果糖比活性高出755％。
实例12亲本葡萄糖异构酶热稳定性测定将按实例8获得的部分纯化的亲本葡萄糖异构酶置于7只1.5ml离心管中。每只离心管分别加入200μl酶液，并加入200μl矿物油。将离心管置于80℃水浴中，0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、32小时、72小时后分别取出一管酶液，离心(10℃，17，800g，20分钟)后，取上清液，按实例10所述测定葡萄糖异构酶残余蛋白和残余比活性。图2显示亲本葡萄糖异构酶在80℃的热稳定。
实例13葡萄糖异构酶突变体热稳定性测定葡萄糖异构酶突变体MGI-4B之热稳定性测定与实例12同。图2显示葡萄糖异构酶突变体MGI-4B在80℃的热稳定。如图所示，亲本葡萄糖异构酶在80℃的半衰期为3.5小时；MGI-4B为16小时。
实例14亲本葡萄糖异构酶生化常数测定配制底物溶液SB含磷酸钠-MgCl2-CoCl2缓冲溶液[20mM磷酸钠(pH 6.5)、250μM CoCl2、5mM MgCl2]和2M D-果糖，调pH至6.5。用同样的磷酸钠-MgCl2-CoCl2缓冲溶液将底物溶液SB稀释至含D-果糖1.8M、1.6M、1.4M、1.2M、1.0M、0.8M、0.6M、0.4M、0.2M、0.1M、0.05M和0.025M。取10μl部分纯化的亲本葡萄糖异构酶(见实施例8)与90μl不同浓度的底物溶液SB在65℃或80℃反应10分钟。然后，按米-曼(Michaelis-Menten)方程并采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，测定米氏常数Km、饱和底物浓度下的最大反应速率Vmax与转换数Kcat。其结果如下表2所列。
实例15葡萄糖异构酶突变体MGI-4B生化常数之测定葡萄糖异构酶突变体MGI-4B生化常数测定与实例14同。表2显示葡萄糖异构酶突变体MGI-4B与亲本葡萄糖异构酶生化常数之比较。
表2 亲本葡萄糖异构酶(亲本)与葡萄糖异构酶突变体MGI-4B之生化常数

实例16果糖含量标准曲线的制备称取干燥至恒重的果糖90.08mg，加水至25ml溶解，得20mM的果糖标准溶液，用去离子水制备16mM、8mM、4mM、2mM、1mM、0.5mM和0mM等浓度的标准溶液。分别取各浓度的标准溶液450μl加1U MGI-4B，置75℃反应30分钟，反应完成后迅速冷却至室温。反应产物D-葡萄糖通过D-葡萄糖氧化酶法测定如实例10所述。取反应液20μl，加600μl葡萄糖氧化酶试剂A液(由上�？苹�-东菱诊断用品有限公司的葡萄糖试剂盒提供，含≥1.0U/ml过氧化物酶及0.1M磷酸缓冲液，pH6.8)及300μl葡萄糖氧化酶试剂B液(由上�？苹�-东菱诊断用品有限公司的葡萄糖试剂盒提供，含≥15U/ml葡萄糖氧化酶、0.5mM 4-氨基安替比林及0.1mM磷酸缓冲液，pH6.8)，混合后置37℃水浴反应7分钟。反应完成后测定反应物的OD560光吸收值。用果糖浓度对OD560值作标准曲线。结果如下图3所列。其中Y轴代表标准果糖浓度，X轴代表某一标准果糖浓度下的OD560值。例如，标准果糖浓度为4mM时，其OD560为0.24；标准果糖浓度为8mM时，其OD560为0.49。
实例17MGI-4B用于测定精液中果糖的含量(1)标准果糖曲线如实例16所述。对照管用水代替MGI-4B，标准管用10mM的果糖标准溶液代替样品溶液。测定时，先将精液标本于95℃加热30分钟，离心(15000g，15分钟)后，取上清液测定，按下表操作。然后各管于75℃反应30分钟，迅速冷却至室温。反应产物D-葡萄糖测定照实例10进行，求得各管OD560。

精液的果糖浓度按下列公式计算精液的果糖浓度＝(样品管所测OD560-对照管所测OD560)÷标准管所测OD560×标准管果糖的浓度。本实例中采用的精液标本为一30岁男性的精液，测得的样品管、对照管及标准管的OD560分别为0.854、0.012及0.654，则该精液果糖含量为(0.854-0.012)÷0.654×10＝12.87mM。精液中果糖含量的正常范围是9.11-17.67mmol/L。精液果糖降低见于精囊腺炎、囊腺炎发育不全、及性功能减退等所致的不育症(《今日临床检验》丛玉隆、王淑娟主编，中国科学技术出版社，1997年版)。
实例18MGI-4B用于测定精液中果糖的含量(2)标准果糖曲线如实例16所述。对照管用水代替MGI-4B，标准管用10mM的果糖标准溶液代替样品溶液。测定时，取约0.7毫升待测精液标本置于装有约0.5克离子交换树脂Chelex 100(BioRad)的小试管中，混合，10分钟后离心(15000g，15分钟)，取上清液测定，按实例17所列表格方法操作。然后各管于75℃反应30分钟，迅速冷却至室温。反应产物D-葡萄糖测定照实例10进行，求得各管OD560。精液的果糖浓度的计算方法同实例17。本实例中采用的精液标本为一28岁男性的精液，测得的样品管、对照管及标准管的OD560分别为0.921、0.013及0.660，则该精液果糖含量为(0.921-0.013)÷0.660×10＝13.76mM。
实例19MGI-4B用于测定精液中果糖的含量(3)取三支各盛有等量的MGI-4B(约10单位)及离子交换树脂Chelex 100(BioRad)约0.5克的小试管，分别标示为测定管、标准管及空白管，各管分别加待测精液标本、10mM的果糖标准溶液及水各0.5毫升，混合，然后各管于75℃反应30分钟，迅速冷却至室温，离心(15000g，15分钟)，取上清液照实例10测定反应产物D-葡萄糖，求得各管OD560。精液的果糖浓度的计算方法同实例17。本实例中采用的精液标本为一38岁男性的精液，测得的样品管、对照管及标准管的OD560分别为1.02、0.015及0.658，则该精液果糖含量为(1.02-0.015)÷0.658×10＝15.27mM。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
序列表<110>百瑞全球有限公司(Bioright Worldwide Company，Ltd.)<120>葡萄糖异构酶突变体及其应用<130>FI-040039-59<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1320<212>DNA<213>Thermoanaerobacterium saccharolyticum<400>1atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat 60ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag 120catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt 180ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa 240gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc 300catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat 360acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtggggt 420accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct 480gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt 540ggccgcgaaa actacgtatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca 600gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca 660aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa 720catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac 780
aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa 840catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatacaggc 900gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt 960gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1020aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1080gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1140aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1200ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1260aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa1320<210>2<211>439<212>PRT<213>Thermoanaerobacterium saccharolyticum<400>2Met Asn Lys Tyr Phe Glu Asn Val Ser Lys Ile Lys Tyr Glu Gly Pro1 5 10 15Lys Ser Asn Asn Pro Tyr Ser Phe Lys Phe Tyr Asn Pro Glu Glu Val20 25 30Ile Asp Gly Lys Thr Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ser Ile Ala Tyr35 40 45Trp His Thr Phe Thr Ala Asp Gly Thr Asp Gln Phe Gly Lys Ala Thr50 55 60Met Gln Arg Pro Trp Asn His Tyr Thr Asp Pro Met Asp Ile Ala Lys65 70 75 80
Ala Arg Val Glu Ala Ala Phe Glu Phe Phe Asp Lys ILe Asn Ala Pro85 90 95Phe Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Asp Thr Leu100 105 110Arg Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Thr Ile Val Ala Met Ile Lys Asp115 120 125Tyr Leu Lys Thr Ser Lys Thr Lys Val Leu Trp Gly Thr Ala Asn Leu130 135 140Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ser Thr Ser Cys Asn Ala145 150 155 160Asp Val Phe Ala Tyr Ser Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile165 170 175Thr Lys Glu Leu Gly Arg Glu Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu180 185 190Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Glu Leu Glu Leu Asp Asn195 200 205Phe Ala Arg Phe Leu His Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly210 215 220Phe Glu Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys225 230 235 240His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Asn Val Leu Ala Phe Leu Arg Lys245 250 255
Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Val Asn Ile Glu Ala Asn His Ala260 265 270Thr Leu Ala Phe His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile275 280 285Asn Gly Val Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Thr Gly Asp Met Leu Leu290 295 300Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp ILe Arg Met Thr Thr Leu305 310 315 320Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu325 330 335Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu340 345 350Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Lys355 360 365Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Lys Phe Ile Glu370 375 380Glu Arg Tyr Ala Ser Tyr Lys Glu Gly Ile Gly Ala Asp Ile Val Ser385 390 395 400Gly Lys Ala Asp Phe Lys Ser Leu Glu Lys Tyr Ala Leu Glu His Ser405 410 415Gln Ile Val Asn Lys Ser Gly Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu420 425 430
Asn Gln Tyr Leu Phe Ala Glu435<210>3<211>1320<212>DNA<213>Thermoanaerobacterium saccharolyticum<220>
<221>misc feature<222>(415)..(417)<223>“n”代表a，t，g或c；并且“nnn”代表除色氨酸之外的任何密码子<220>
<221>misc feature<222>(544)..(546)<223>“n”代表a，t，g或c；并且“nnn”代表除精氨酸之外的任何密码子<220>
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<221>misc feature<222>(895)..(897)<223>“n”代表a，t，g或c；并且“nnn”代表除苏氨酸之外的任何密码子<400>3atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat 60ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag 120catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt 180
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<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(139)..(139)<223>“Xaa”代表除色氨酸之外的任何氨基酸<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(299)..(299)<223>“Xaa”代表除苏氨酸之外的任何氨基酸<400>4Met Asn Lys Tyr Phe Glu Asn Val Ser Lys Ile Lys Tyr Glu Gly Pro1 5 10 15Lys Ser Asn Asn Pro Tyr Ser Phe Lys Phe Tyr Asn Pro Glu Glu Val20 25 30Ile Asp Gly Lys Thr Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ser Ile Ala Tyr35 40 45Trp His Thr Phe Thr Ala Asp Gly Thr Asp Gln Phe Gly Lys Ala Thr50 55 60
Met Gln Arg Pro Trp Asn His Tyr Thr Asp Pro Met Asp Ile Ala Lys65 70 75 80Ala Arg Val Glu Ala Ala Phe Glu Phe Phe Asp Lys Ile Asn Ala Pro85 90 95Phe Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Asp Thr Leu100 105 110Arg Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Thr Ile Val Ala Met Ile Lys Asp115 120 125Tyr Leu Lys Thr Ser Lys Thr Lys Val Leu Xaa Gly Thr Ala Asn Leu130 135 140Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ser Thr Ser Cys Asn Ala145 150 155 160Asp Val Phe Ala Tyr Ser Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile165 170 175Thr Lys Glu Leu Gly Xaa Glu Asn Tyr Xaa Xaa Trp Gly Gly Arg Glu180 185 190Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Glu Leu Glu Leu Asp Asn195 200 205Phe Ala Arg Phe Leu His Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly210 215 220Phe Glu Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys225 230 235 240
His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Asn Val Leu Ala Phe Leu Arg Lys245 250 255Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Val Asn Ile Glu Ala Asn His Ala260 265 270Thr Leu Ala Phe His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile275 280 285Asn Gly Val Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Xaa Gly Asp Met Leu Leu290 295 300Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu305 310 315 320Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu325 330 335Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu340 345 350Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Lys355 360 365Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Lys Phe Ile Glu370 375 380Glu Arg Tyr Ala Ser Tyr Lys Glu Gly Ile Gly Ala Asp lle Val Ser385 390 395 400Gly Lys Ala Asp Phe Lys Ser Leu Glu Lys Tyr Ala Leu Glu His Ser405 410 415
Gln Ile Val Asn Lys Ser Gly Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu420 425 430Asn Gln Tyr Leu Phe Ala Glu435<210>5<211>439<212>PRT<213>Thermoanaerobacterium saccharolyticum<400>5Met Asn Lys Tyr Phe Glu Asn Val Ser Lys Ile Lys Tyr Glu Gly Pro1 5 10 15Lys Ser Asn Asn Pro Tyr Ser Phe Lys Phe Tyr Asn Pro Glu Glu Val20 25 30Ile Asp Gly Lys Thr Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ser Ile Ala Tyr35 40 45Trp His Thr Phe Thr Ala Asp Gly Thr Asp Gln Phe Gly Lys Ala Thr50 55 60Met Gln Arg Pro Trp Asn His Tyr Thr Asp Pro Met Asp Ile Ala Lys65 70 75 80Ala Arg Val Glu Ala Ala Phe Glu Phe Phe Asp Lys Ile Asn Ala Pro85 90 95Phe Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Asp Thr Leu100 105 110Arg Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Thr Ile Val Ala Met Ile Lys Asp
115 120 125Tyr Leu Lys Thr Ser Lys Thr Lys Val Leu Phe Gly Thr Ala Asn Leu130 135 140Phe Ser Asn Pro Arg Phe Val His Gly Ala Ser Thr Ser Cys Asn Ala145 150 155 160Asp Val Phe Ala Tyr Ser Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile165 170 175Thr Lys Glu Leu Gly Ala Glu Asn Tyr Thr Phe Trp Gly Gly Arg Glu180 185 190Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Glu Leu Glu Leu Asp Asn195 200 205Phe Ala Arg Phe Leu His Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly210 215 220Phe Glu Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys225 230 235 240His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Asn Val Leu Ala Phe Leu Arg Lys245 250 255Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Val Asn Ile Glu Ala Asn His Ala260 265 270Thr Leu Ala Phe His Asp Phe Gln His Glu Leu Arg Tyr Ala Arg Ile275 280 285Asn Gly Val Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Met Leu Leu
290 295 300Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asp Ile Arg Met Thr Thr Leu305 310 315 320Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Met Gly Gly Phe Asp Lys Gly Gly Leu325 330 335Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Pro Glu Asp Leu340 345 350Phe Leu Gly His Ile Ala Gly Met Asp Ala Phe Ala Lys Gly Phe Lys355 360 365Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Asp Lys Phe Ile Glu370 375 380Glu Arg Tyr Ala Ser Tyr Lys Glu Gly Ile Gly Ala Asp Ile Val Ser385 390 395 400Gly Lys Ala Asp Phe Lys Ser Leu Glu Lys Tyr Ala Leu Glu His Ser405 410 415Gln Ile Val Asn Lys Ser Gly Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Leu420 425 430Asn Gln Tyr Leu Phe Ala Glu43权利要求
1.一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中的SEQ ID NO.2为参考序列，具有在第186位的突变和选自第139位、第182位、第187位和第299位的至少三个突变，所述第139位的色氨酸突变为赖氨酸(Lys)、或丝氨酸(Ser)、或半胱氨酸(Cys)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或天冬酰胺(Asn)、或苯丙氨酸(Phe)，所述第182位的精氨酸突变为脯氨酸(Pro)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或缬氨酸(Val)，所述第186位的缬氨酸突变为苏氨酸(Thr)、或丙氨酸(Ala)、或天门冬氨酸(Asp)，所述第187位的苯丙氨酸突变为甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或脯氨酸(Pro)，以及所述第299位的苏氨酸突变为异亮氨酸(Ile)、或酪氨酸(Tyr)、或半胱氨酸(Cys)、或蛋氨酸(Met)、或谷氨酸(Glu)、或谷氨酰胺(Gln)。
2.权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征在于具有SEQ ID NO.4所列的氨基酸序列，其中第139位的X代表苯丙氨酸(Phe)、第182位的X代表丙氨酸(Ala)、第186位的X代表苏氨酸(Thr)，第187位的X代表苯丙氨酸，同时第299位的X代表谷氨酰胺(Gln)。
3.一种DNA，其含有编码权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列。
4.一种质粒，其含有权利要求3所述的DNA。
5.权利要求4所述的质粒，其含有编码SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的DNA。
6.权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶突变体的应用，其中所述的葡萄糖异构酶突变体用于测定果糖含量。
7.权利要求6所述的应用，其中所述的葡萄糖异构酶突变体用于测定人体精液的果糖含量。
8.一种测定人精液中果糖含量的方法，包括如下步骤1)获取人精液样品；2)将权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶突变体加入到精液样品中，获得反应混合物；3)将反应混合物在65-80℃反应20-40分钟；和4)测得反应结束后反应混合物中的果糖含量。
9.权利要求8所述的方法，其中在进行步骤2)之前，还包括除去精液样品中的蛋白的步骤。
10.权利要求9所述的方法，其中所述除去精液中蛋白的步骤是通过将精液样品与离子交换树脂接触而实现的。
11.权利要求9所述的方法，其中所述除去精液样品中蛋白的步骤是通过将精液样品在90-100℃加热20-40分钟后再离心而实现的。
12.权利要求8-11任一项所述的方法，其中在步骤4)中反应混合物在75℃下反应30分钟。
13.一种用于测定人精液中果糖含量的试剂盒，其特征在于含有权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶突变体。
14.权利要求13所述的试剂盒，还包括-离子交换树脂；和-葡萄糖氧化酶。
15.权利要求13或14所述的试剂盒，还包括果糖浓度标准溶液。
全文摘要
本发明披露利用基因突变技术改良的一系列具有耐热高催化活性性能、适合于测定果糖含量的Thermoanaerobacterium saccharolyticum葡萄糖异构酶。以序列表中的序列2为参考序列，这些葡萄糖异构酶突变体具有在第186位的突变和选自第139位、第182位、第187位和第299位的至少三个突变，可以果糖为底物生成葡萄糖，进而用于测定人体内、或体内某一器官、或其它生物体、或商品中果糖的含量。
文档编号G01N33/50GK1743454SQ20041007365
公开日2006年3月8日申请日期2004年9月2日优先权日2004年9月2日
发明者王骏, 傅荣昭, 金彩科, 沈冬申请人:百瑞全球有限公司

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葡萄糖异构酶突变体及其应用的制作方法