专利名称：尿中ii型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医疗器械领域，具体地是涉及一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒及其制备。
背景技术：
软骨结构完整性的损伤是骨关节炎和类风湿关节炎的主要组织学表现。II型胶原蛋白是软骨的主要有机成分。软骨降解后，II型胶原蛋白的片段(CTX-II)释放进入循环系统，随后排入尿中。尿中的CTX-II片段可由尿中II型胶原降解产物检测试剂盒定量检測。据报道，尿中II型胶原降解产物检测有助于预测骨关节炎的发展及其它临床和临床如研究。
发明内容
本发明的目的之ー是提供一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒,主要包括有(A)生物素标记的CTX-II抗原CTX-II抗原的浓度为4. 5-5. 5 U g/ml ；(B)CTX-II单克隆抗体溶液，该CTX-II单克隆抗体滴度为I 950-1 1050 ；所述生物素标记的CTX-II抗原与CTX-II单克隆抗体溶液的用量比为1:1。进ー步地，所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，还包括有过氧化物酶偶联抗体和包被链菌抗生物素蛋白的微孔板；所述酶偶联抗体的工作滴度为I : 4550-5050。优选地，所述CTX-II抗原的浓度为5 i! g/ml，所述CTX-II单克隆抗体的滴度为I 1000。本发明另一目的是提供一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的制备方法。实现上述目的的技术方案为一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤I)制备生物素标记的CTX-II抗原；取CTX-II合成肽25mg，与IOmL浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液；取浓度为I. 25mg/mL的生物素，抗原稀释液生物素=I 4体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标记的CTX-II抗原，加入防腐剂和稳定剂；所述CTX-II抗原的浓度为
4.5-5. 5 u g/ml ；2)制备CTX-II单克隆抗体溶液取CTX-II单克隆抗体，用I Ommo I/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入红色素为显色剂，所述CTX-II单克隆抗体滴度为I 950-1 1050。优选地，所述红色素的浓度为0. 03mg/ml。所述CTX-II单克隆抗体的制备为取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔58处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL ;拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。
所述尿II型胶原降解产物检测试剂盒还包括有过氧化物酶偶联抗体，该过氧化物酶偶联抗体的制备为取鼠抗兔IgG冻干粉0. Ig,与IOmL浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合；取HRP固体(辣根过氧化物酶)用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与鼠抗兔IgG交联；取制备后的鼠抗兔IgG，用lOmmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入蓝色素为显色剂，蓝色素的浓度为0. 08mg/ml，再加入防腐剂和稳定剂。所述酶偶联抗体的工作滴度为I : 4550-5050，优选为I : 5000。本发明所述试剂盒采用酶联免疫法，基于ー种单克隆抗体对尿II型胶原片段，或对结合于链霉抗生物素蛋白包被的微孔内表面的生物素标记合成肽的竞争性结合。首先，生物素标记的合成肽结合于包被有链霉抗生物素蛋白的微孔板内表面。清洗之后，加入标准品、质控品和尿样，然后加入单克隆抗体溶液。再次清洗，并加入过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白。再次清洗后，加入生色底物，用硫酸终止显色反应并測定吸光度。本发明所述的尿II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非�：玫挠诺�。
具体实施例方式实施例I(一 )、本实施例所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的主要组成成份如下I.链霉抗生物素蛋白包被的微孔板链霉抗生物素蛋白预包被的条形微孔板(12条X8孔)，置于框架中。2 尿 CTX-II 标准品 0可直接使用的含有蛋白质稳定剂、去污剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液，I瓶(至少3. OmT,)。3.尿 CTX-II 标准品 1-5可直接使用的合成肽溶于TRIS缓冲溶液中，合成肽的准确浓度标在各瓶上，5瓶(至少0. 4mL/瓶)。4 尿 CTX-II 质控品可直接使用的合成肽，2瓶(至少0. 4mL)。5.生物素标记的尿CTX-II抗原可直接使用的生物素标记合成肽I瓶(至少12. OmL)。6. 一抗体溶液可直接使用的单克隆抗体(溶于含蛋白质稳定剂、防腐剂和红色染料的TRIS缓冲溶液中)I瓶(至少12. OmL)。7.过氧化物酶偶联抗体可直接使用的过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白(溶于含去污剂、防腐剂和蓝色染料的TRIS缓冲溶液中)I瓶(至少12. OmL)。8.底物溶液可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)。I瓶(至少12. OmL)。9.终止液可直接使用的0. 18M硫酸溶液。I瓶(至少12. OmL)。10.清洗溶液(50 X)含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。I瓶(至少20. OmL)。11.封 ロ膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。所述试剂盒的制备如下一)标准品与质控品I)来源CTX-II 合成妝冻干粉购自 Nordic Bioscience Diagnostic A/S 公司。2)质控品制备将CTX-II合成肽冻干粉与lOmmol/L的TRIS缓冲液混合，质控品I中CTX-II浓度约为I. 50 u g/L，质控品2中CTX-II浓度约为4. 50 u g/L，并加入10A的BSA和0. 018 %的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，各取0. 4mL分装，4°C密封保存。3)标准品制备标准品0取3mL浓度10mmol/L的TRIS缓冲液，加入I %的BSA和0. 018 %的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。标准品1-5取CTX-II合成肽冻干粉，分别用lOmmol/L的TRIS缓冲液稀释至CTX-II 浓度为 0. 75 ii g/L、I. 25 u g/L,2. 50 u g/L,5. 00 u g/L 10. OOu g/L 各取 0. 4mL
分装，4 °C密封保存。ニ)生物素标记的CTX-II抗原取CTX-II合成肽25mg，与IOmL浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液；取浓度为I. 25mg/mL的生物素，抗原稀释液生物素=I 4体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标记的CTX-II抗原，加入1%的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存，所述CTX-II抗原浓度为 5 u g/ml o三)ー抗溶液I)抗体制备取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫 注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL。拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入含有1%的BSA、0. 1%的Tween 20和0. 0075%的Bronidox的溶液5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。2) ー抗溶液制备取制备后的CTX-II单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入红色素做为显色剂，其浓度为0. 03mg/ml，取12mL分装，4°C密封保存，所述CTX-II单克隆抗体滴度为I : 1000。一抗浓度的选择稀释度测定先将0. Iml的生物素标记抗原加入预包被链酶抗生物素蛋白的微孔板，洗涤后加一系列不同稀释度(I 1000,1 2000,1 3000，I 4000,1 5000,1 6000)的一抗进行孵育，洗涤后加入0. Iml的过氧化物酶偶联抗体孵育，洗涤后加底物显色，加終止液終止反应。在酶标比色计中測定不同稀释度的ー抗OD值，选择OD值> 1.0的那个ー抗稀释度即为ー抗的使用浓度。最終确定ー抗的最佳工作浓度为 I : 1000。四)过氧化物酶偶联抗体 通用鼠抗兔IgG冻干粉购自英国Abcam公司。取鼠抗兔IgG冻干粉0. Ig,与IOmL浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合。取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与鼠抗兔IgG交联。取制备后的鼠抗兔IgG，用lOmmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合,加入蓝色素做为显色剂,蓝色素的浓度为0. 08mg/ml,再加入1%的BSA,0. 1%的Tween20和0. 0075%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，取12mL分装，4°C密封保存。所述酶偶联抗体的工作滴度为I : 5000。五)其他预包被链菌抗生物素蛋白的微孔板、底物液、终止液和冲洗液均由其他商业公司提供。实施例2 :运用实施例I所述的试剂盒对尿中II型胶原降解产物检测使用前，将所有溶液平衡至室温(18_22°C)。确定实验所需微孔板数量。每ー样本设两个平行孔。另外，每轮实验共需要14孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。具体包括以下步骤I)预孵育向各孔加入IOOii L生物素标记的尿CTX-II抗原，用封ロ膜密封，室温(18_22°C)下孵育30±5分钟，不要震荡。2)清洗清洗缓冲溶液(50 X)以I体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。手工清洗微孔板5次。使用自动洗板机，通常清洗5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔中的溶液倒干净。3) 一次孵育向适当的孔中加入40ii L尿CTX-II标准品(0_5)，质控品或待测尿样，再加入IOOiI L —抗体溶液。用封ロ膜密封微孔板，在冰箱中(2-8°C)孵育21±3小时，不要震荡。4)清洗见第2步。5) 二次孵育向各孔加入IOOy L过氧化物酶偶联抗体溶液。用封ロ膜密封微孔板，室温(18-22°C )下孵育60±5分钟，不要震荡。6)清洗见第2步。7)与生色底物溶液孵育向各孔加入IOOii L底物溶液，用封ロ膜密封，室温(18_22°C )下避光孵育15±2分钟，不要震荡。8)终止显色反应向各孔加入100 U L终止溶液。9)测定吸光度在2小时内以650nm为參照测定450nm下的吸光度。检测范围如果待测样本的吸光度低于标准5，建议用标准品0稀释样本并重新分析。
质量控制參考值(參考范围)各类人群的平均值和标准偏差举例如下。
人群人数年龄CTX-IISD
(岁)
平均值(ng/mmol ) ( ng/mmol ) 所有妇女459 20-8529979-113权利要求
1.一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，主要包括有 (A)生物素标记的CTX-II抗原CTX-II抗原的浓度为4.5-5. 5 u g/ml ； (B)CTX-II单克隆抗体溶液，该CTX-II单克隆抗体工作滴度为I: 950-1 1050 ； 所述生物素标记的CTX-II抗原与CTX-II单克隆抗体溶液的用量比为I : I。
2.根据权利要求I所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，还包括有过氧化物酶偶联抗体和包被链菌抗生物素蛋白的微孔板；所述酶偶联抗体的工作滴度为I 4550-5050。
3.根据权利要求I或2所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述CTX-II抗原的浓度为5 u g/ml，所述CTX-II单克隆抗体的滴度为I : 1000。
4.一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的制备方法，其特征是，主要包括以下步骤 1)制备生物素标记的CTX-II抗原；取CTX-II合成肽25mg，与IOmL浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液；取浓度为I. 25mg/mL的生物素，抗原稀释液生物素=I 4体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标记的CTX-II抗原，加入防腐剂和稳定剂；所述CTX-II抗原的浓度为4. 5-5. 5 u g/ml ； 2)制备CTX-II单克隆抗体溶液取CTX-II单克隆抗体，用lOmmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入红色素为显色剂，所述CTX-II单克隆抗体滴度为I 950-1 1050。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，红色素的浓度为0.03mg/ml。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述CTX-II单克隆抗体的制备为取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周分别注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL ;拉颈处死家兔,收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述尿￠-11型胶原降解产物检测试剂盒还包括有过氧化物酶偶联抗体，该过氧化物酶偶联抗体的制备为取鼠抗兔IgG冻干粉0. Ig,与IOmL浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合；取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与鼠抗兔IgG交联；取制备后的鼠抗兔IgG，用lOmmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入蓝色素为显色剂，显色剂的浓度为0. 08mg/ml，再加入防腐剂和稳定剂，所述酶偶联抗体的工作滴度为I : 4550-1 5050。
全文摘要
本发明公开了一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要包括有生物素标记的CTX-II抗原CTX-II抗原的浓度为4.5-5.5μg/ml；CTX-II单克隆抗体溶液，该CTX-II单克隆抗体滴度为1∶950-1∶1050；所述生物素标记的CTX-II抗原与CTX-II单克隆抗体溶液的用量比为1∶1。所述尿中II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非�：玫挠诺�。
文档编号G01N33/68GK102650638SQ201110045599
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者郭志程 申请人:广州固康生物科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
