专利名称：应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及植物基因尤其是白芥抗旱相关候选基因的筛选方法。
背景技术：
植物的抗旱性是一个复杂的多基因控制系统，抗旱的转录因子可以调控一系列抗旱相关基因的表达，是一种十分有效的提高耐旱性的途径。目前，已有研究从各种植物中发现和鉴定了几十种与抗旱性相关的功能基因。白芥是十字花科植物重要的育种基因资源，受到欧美及国内一些学者的高度重 视。通过远缘杂交，可以将白芥重要的抗性基因资源导入农作物等其他植物体内，因此白芥已成为创制作物新种质的重要的原始材料。白芥具有较强的抗旱性能(王艳萍等，2001 ;唐道城，2000),是重要的抗旱种质资源，筛选相关抗旱基因对开展抗旱基因工程研究具有重要意义针对白芥这一物种，Dong等(2012)报道了白芥在干旱和复水条件下叶片基因差异表达情况，发现由于干旱胁迫造成叶片中309个基因表达下调，248个基因表达上调。张宁宁(2012)采用PEG模拟干旱处理方法研究了白芥幼苗在干旱胁迫下的生理生化响应和应对干旱胁迫条件下的柠檬酸合酶表达情况。但两者均没有对具体的白芥相关抗旱基因及其筛选或克隆方法进行探讨。基因筛选通常根据其植物体内的差异表达进行。比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，分离并克隆不同组织或同一组织不同发育阶段差异表达的基因，不仅是研究生命过程分子机制的基�。彩墙泄δ芑蜃檠Я煊蜓芯康那疤�。目前，筛选差异表达基因的方法主要有差别筛选技术、消减杂交技术、mRNA差异显示技术、基因表达系列分析、抑制性消减杂交、基因芯片技术、Gene Calling技术等。但现有的筛选技术过分依赖于这些基因生物学功能和生物学表型，但是到目前为止，大多数生物学表型和基因生物学功能是未知的，因此，这些候选基因筛选方法的利用受到了很大的限制。植物体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色。蛋白质组学(Proteomics )研究涉及到对蛋白质组的组成成分即蛋白质组表达模式的研究，同时涉及到蛋白质组的功能即蛋白质组功能模式的研究。对蛋白质组成的分析鉴定是蛋白质组学与基因组学相对应的主要内容，它要求对蛋白质进行分离、鉴定的图谱化。研究蛋白质组学的技术路线主要有两条，一条是以双向电泳加生物质谱的方法鉴定生物体系中各种蛋白的表达谱以及各蛋白表达程度的相对变化，另一条路线就是多维色谱与生物质谱相结合的称之为鸟枪法的技术路线。其中国内外大多数研究是以双向电泳为主要手段。双向凝胶电泳(2-DE)技术是蛋白质高通量分离的首选技术，包括根据等电点原理对蛋白质进行等电聚焦的“一向”电泳和根据分子量不同进行SDS-PAGE的“二向”电泳。电泳后需要经过聚丙烯酰胺凝胶染色和蛋白点的图象分析。经双向电泳分离得到的目标蛋白质首先经胰蛋白酶酶解处理形成肽段，而后可以对得到的肽段用质谱技术来鉴定和分析
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种筛选植物(尤其是白芥)抗旱相关候选基因的方法，用以克服现有技术筛选效率不高的问题。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其步骤包括A、分别取干旱处理组和正常浇水处理组植物植株叶片，首先利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；B、再通过质谱鉴定技术对所得差异蛋白进行复筛，进一步筛选获取与植物抗旱相关的候选基因。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A的具体操作步骤包括 A-1、植物材料与叶片蛋白提取分别取干旱处理组和正常浇水处理组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品；A-2、双向凝胶电泳处理对上步所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用PH4-7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h以上，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到干旱处理叶片与正常浇水叶片的蛋白双向凝胶电泳图；A-3、结果分析对上步所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对对照组与处理组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在
I log2expression ratio I会I、Ρ〈0· 05条件下对对照组与处理组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A-I的具体操作步骤为a、取植物种子在培养室内进行催芽后，PEG6000处理浓度为20%，以清水处理为对照，选取经浓度为20%的PEG6000处理第9天的植物幼苗叶片为实验组和不做任何处理的植物幼苗叶片的为对照组进行O蛋白质差异性表达试验；b、植物幼苗经PEG6000模拟干旱处理结束后同时取实验组和对照组植株叶片，双蒸水冲洗干净后，用滤纸吸掉多余水分，迅速置于液氮中冷却分装标记后，置于-80°C冰箱中保存备用；C、在液氮中充分研磨叶片，加入样品体积3倍的提取液在_20°C的条件下过夜，然后4°C 8000rpm以上离心I小时，弃上清，加入等体积的含O. 07% β -巯基乙醇的冰浴丙酮，摇匀后4°C SOOOrpm以上离心I小时，然后真空干燥沉淀，备用；d、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后15 0C 8000rpm以上离心I小时或更长时间，以没有沉淀为标准，临时保存在4°C，用Brandford法定量蛋白，然后分装放入-80°C备用；作为本发明的一种优选技术方案，步骤c中的提取液为含10%TCA和O. 07%的β-巯基乙醇的丙酮；步骤d中裂解液的配制比例为2. 7g尿素O. 2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中，终体积为5ml，使用前再加入IM的DTT65ul/ml。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A得到的蛋白样品分别进行了双向电泳和考马斯亮蓝染色处理，并通过分析获得差异蛋白质点，在此基础上，步骤B的具体操作步骤为首先从凝胶上切下差异蛋白质点，然后进行质谱分析和蛋白鉴定。作为本发明的一种优选技术方案，所述质谱分析的具体操作步骤包括I)将要进行质谱分析的凝胶用超纯水清洗5min/次X 5次；2)根据所要分析的蛋白质点浓度及大小切去1000 μ I Eppondorf枪头尖端,使用切好的枪头从上述凝胶中切取所要分析的蛋白质点放入1.5ml EP管中；3)每管中加入100 μ I超纯水,室温下利用摇床震荡洗漆15min,吸去超纯水；重复此步骤两次；4)每管中加入100 μ I胶内酶切脱色液，室温下利用摇床震荡脱色30min，吸去胶内酶切脱色液；重复此步骤4次至胶粒呈无色透明状； 5)每管中加入100 μ I乙腈，室温下摇床震荡脱水lOmin，吸去乙腈；6)抽真空干燥25min至胶粒呈白色颗粒状；7)每管中加入10 μ I酶液，置于4°C保持lh，吸去多余酶液；8)将EP管倒置，37°C保持12_14h，使蛋白质进行完全酶切；9)每管中加入30μ I肽段抽提液I，37°C保持lh，取上清液至新管内；10)向含胶粒的EP管中加入30 μ I肽段抽提液II，30°C保持lh，取上清液至步骤9中的含有上清液的管内；11)将所得到的含有肽段的抽提液进行真空干燥Ih左右，至余液为10μ I ；12)将O. 8 μ I肽段抽提液加到样品靶上，待样品干燥后重复加样一次；13)在近干的样品上加O. 5 μ I基质；14)用I μ I的1%。TFA洗液清洗靶位，保持30S ;重复两次；15)待样品完全干燥后将样品板置于Bruker Daltonics Autof Iex中进行分析,得到蛋白样品的肽质量指纹图，即酶解蛋白的所有肽段的质量分布图。作为本发明的一种优选技术方案，所述蛋白鉴定的具体操作过程为通过本地化的MASCOT软件在NCBInr 20100116数据库中进行蛋白质检索，与数据库中已知的所有蛋白指纹进行匹配，设定参数为Max Mwassed Cleavages :I ;Fixed Modifications ；Carboxymethyl (C) ；Vaviable Modifications 0xidation (M) ；Mass values :MH+、Monowasotopic ；Peptide Mass Tolerance ±0. 2Da ;若鉴定结果得分大于 85 分，即P〈0. 05，说明搜索结果可信。作为本发明的一种优选技术方案，步骤B之后进一步利用RT — PCR技术对所筛选出的抗旱候选基因进行验证。作为本发明的一种优选技术方案,步骤B之后进一步利用WesternBlot技术对所筛选出的抗旱候选基因进行验证。作为本发明的一种优选技术方案，所述植物为白芥。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本发明提供了能够高效筛选与植物(尤其是白芥)抗旱性能相关候选基因的方法，本发明实施例利用该方法鉴定了一些白芥抗旱相关的候选基因；本发明方法对克隆白芥抗旱性状的优质基因提供了一个方法借鉴；在利用转基因技术培育抗旱植物品种上具有很重要的参考价值。其优点和效果分述如下①能快速和有效地筛选到与白芥抗旱相关联的候选基因；②本发明很好地利用2-DE这一高通量、准确的蛋白质组学研究手段来研究与白芥抗逆性状相关的候选基因；③可以广泛应用于植物抗旱等抗逆性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗逆性强的植物(作物)新品种。
图I正常浇水处理幼苗叶片(A)和20%PEG6000处理第9天时白芥幼苗叶片(B)。图2白芥干旱处理与正常浇水幼苗叶片蛋白双向凝胶电泳图；图中，A :对照组白芥幼苗叶片2-DE图谱；B PEG6000处理组白芥幼苗叶片2-DE图谱。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例I白芥抗旱相关基因的筛选一、利用2-DE技术分析干旱处理与正常浇水处理(对照)白芥幼苗叶片差异蛋白I.植物材料与叶片蛋白提取白芥种子为本实验室保存。白芥种子在培养室内进行催芽后，PEG6000处理浓度为20%，以清水处理为对照。选取经浓度为20%的PEG6000处理第9天的白芥幼苗叶片为实验组和不做任何处理的白芥幼苗叶片的为对照组进行蛋白质差异性表达试验。白芥幼苗经PEG6000模拟干旱处理结束后同时取实验组和对照组植株叶片，双蒸水冲洗干净后，用滤纸吸掉多余水分，迅速置于液氮中冷却分装标记后，置于-80°C冰箱中保存备用。在液氮中充分研磨叶片。加入样品体积3倍的提取液在-20°C的条件下过夜，然后离心(4°C 8000rpm以上I小时)弃上清。加入等体积的冰浴丙酮(含O. 07%的β -巯基乙醇)，摇匀后离心(4°C SOOOrpm以上I小时)，然后真空干燥沉淀，备用。上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15°C 8000rpm以上I小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4°C待用。用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入_80°C备用。药品提取液含10%TCA和O. 07%的β -巯基乙醇的丙酮。裂解液2. 7g尿素
O.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入IM的DTT65ul/ml。2.蛋白浓度的测定按照Bradford法(考马斯亮蓝法)进行测定取5支EP管,按下表分别在各管中加入上述试剂后充分混匀，静置2min后，Ih之内，以超纯水为空白，测定A595nm值。以蛋白含量为横坐标，A595nm值为纵坐标，绘制标准曲线。采用分光光度计在595nm处测定样本蛋白吸光值。3.双向凝胶电泳(2D-PAGE)双向电泳参照甘露等的方法，等电聚焦采用pH4_7的预制IPG胶条(长17cm)进行；待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h以上，然后放入考马斯亮蓝G-250染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶30min之后即可进行凝胶图像扫描。得到的为附图2所示的白芥干旱处理与正常浇水幼苗叶片蛋白双向凝胶电泳图。图像分析结果显示，在对照组中检测到了 135个蛋白质点；在处理组中检测到了162个蛋白质点。通过比较图中的对照组与处理组蛋白质的表达图谱，发现它们之间存在120个共有蛋白质，这些共有蛋白质占对照组表达的总蛋白质数的近89%，占处理组表达的数目的近74%。这说明这些蛋白质作为白芥体内的保守蛋白发挥作用，为白芥的正常生理活动提供了所必须。利用单因素方差分析(one-way AN0VA)及对对照组与处理组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换，选择在I log2expression ratio I = 1> P<0. 05条件下对对照组与处理组蛋白质表达谱进行统计学分析，共发现了 58个差异蛋白质。其中，对照组中有16个特有蛋白质；处理组中有42个特有蛋白质。在处理组中有21个蛋白质的表达量显著低于对照组；有22个蛋白质的表达量显著高于对照组。这些差异蛋白质包括特有蛋白质的表达及表达量上下浮动可能是由于外界 干旱环境条件的不同造成的差异。因此，20%PEG6000处理9天后叶片中高表达的蛋白质可能有利于增强白芥的抗旱性，以使其更能够适应干旱环境的变化。二、差异蛋白点的质谱鉴定选取上述百分体积值(vol%)为2倍以上的10个特异的差异蛋白点(其中5个得到鉴定，5个没有搜索到与之相匹配的数据结果)进行质谱分析，编号分别为G12、G13、G14、G15、G16、G17、G18、G19、G20、G21。质谱分析I)将要进行质谱分析的凝胶用超纯水清洗清洗5min/次X 5次。2)根据所要分析蛋白质点浓度及大小切去一定长度的1000 μ IEppondorf枪头尖端，使用切好的枪头从上述凝胶中切取所要分析的蛋白质点放入1.5ml EP管中。3)每管中加入100 μ I超纯水,室温下利用摇床震荡洗漆15min,吸去超纯水。重复此步骤两次。4)每管中加入100 μ I胶内酶切脱色液，室温下利用摇床震荡脱色30min,吸去胶内酶切脱色液。重复此步骤4次至胶粒呈无色透明状。5)每管中加入100 μ I乙腈，室温下摇床震荡脱水lOmin，吸去乙腈。6)抽真空干燥25min至胶粒呈白色颗粒状。7)每管中加入10 μ I酶液，置于4°C保持lh，吸去多余酶液。8)将EP管倒置，37°C保持12_14h，使蛋白质进行完全酶切。9)每管中加入30 μ I肽段抽提液I，37°C保持lh，取上清液至新管内。10)向含胶粒的EP管中加入30 μ I肽段抽提液II，30°C保持lh，取上清液至步骤9中的含有上清液的管内。11)将所得到的含有肽段的抽提液进行真空干燥Ih左右，至余液为10μ I。12)将O. 8 μ I肽段抽提液加到样品靶上，待样品干燥后重复加样一次。13)在近干的样品上加O. 5 μ I基质。14)用I μ I的1%。TFA洗液清洗靶位，保持30S。重复两次。15)待样品完全干燥后将样品板置于Bruker Daltonics Autof Iex中进行分析,得到蛋白样品的肽质量指纹图，即酶解蛋白的所有肽段的质量分布图。
蛋白鉴定根据得到的蛋白样品的肽质量指纹图(即通过质谱检测得到的酶解蛋白的所有肽段的质量(或分子量)分布图)，然后通过本地化的MASCOT软件在数据库[NCBInr 20100116]和SP中进行蛋白质检索，设定参数为Max Mwassed Cleavages :I ；FixedModifications ；Carboxymethyl (C) ；Vaviable Modifications Oxidation (M)；Mass values :MH+、Monowasotopic ；Peptide MassTolerance :±0. 2Da ;判定标准每个蛋白会有10个检索结果，当蛋白分数(Protein Score C. I.%)数值达到95以上，结果得分大于85分，即P〈0. 05，说明搜索结果可信。表I白芥干旱处理幼苗叶片组织中高表达且得到鉴定的蛋白质
权利要求
1.应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于 A、分别取干旱处理组和正常浇水处理组植物植株叶片，首先利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因； B、再通过质谱鉴定技术对所得差异蛋白进行复筛，进一步筛选获取与植物抗旱相关的候选基因。
2.根据权利要求I所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤A的具体操作步骤包括 A-1、植物材料与叶片蛋白提取分别取干旱处理组和正常浇水处理组植物植株叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，获取叶片中的蛋白质样品； A-2、双向凝胶电泳处理对上步所得蛋白质样品分别进行双向凝胶电泳处理，等电聚焦采用PH4-7的预制IPG胶条进行，待第二向电泳结束后取下凝胶，放入固定液中室温固定4h以上，然后放入考马斯亮蓝染色液中进行饱和染色，利用清水清洗凝胶之后即进行凝胶图像扫描，得到干旱处理叶片与正常浇水叶片的蛋白双向凝胶电泳图； A-3、结果分析对上步所得双向凝胶电泳图进行统计分析，利用单因素方差分析，对对照组与处理组蛋白质表达量的比值进行以2为底的对数转换,选择在I log2expressionratio I ^ I、P〈0. 05条件下对对照组与处理组蛋白质表达谱进行统计学分析，即获得差异蛋白质；并进一步确定在干旱处理叶片中高表达的蛋白质，即初步筛选出与植物抗旱相关的候选基因。
3.根据权利要求2所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤A-I的具体操作步骤为 a、取植物种子在培养室内进行催芽后，PEG6000处理浓度为20%,以清水处理为对照，选取经浓度为20%的PEG6000处理第9天的植物幼苗叶片为实验组和不做任何处理的植物幼苗叶片的为对照组进行蛋白质差异性表达试验； b、植物幼苗经PEG6000模拟干旱处理结束后同时取实验组和对照组植株叶片，双蒸水冲洗干净后，用滤纸吸掉多余水分，迅速置于液氮中冷却分装标记后，置于-80°C冰箱中保存备用； C、在液氮中充分研磨叶片，加入样品体积3倍的提取液在_20°C的条件下过夜，然后40C 8000rpm以上离心I小时，弃上清，加入等体积的含O. 07%β -巯基乙醇的冰浴丙酮，摇匀后4°C SOOOrpm以上离心I小时，然后真空干燥沉淀，备用； d、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后15°C 8000rpm以上离心I小时或更长时间，以没有沉淀为标准，临时保存在4°C，用Brandford法定量蛋白，然后分装放入-80°C备用；
4.根据权利要求3所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤c中的提取液为含10%TCA和O. 07%的β -巯基乙醇的丙酮；步骤d中裂解液的配制比例为2. 7g尿素O. 2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中，终体积为5ml，使用前再加入IM的DTT65ul/ml。
5.根据权利要求I所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤A得到的蛋白样品分别进行了双向电泳和考马斯亮蓝染色处理，并通过分析获得差异蛋白质点，在此基础上，步骤B的具体操作步骤为首先从凝胶上切下差异蛋白质点，然后进行质谱分析和蛋白鉴定。
6.根据权利要求5所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于所述质谱分析的具体操作步骤包括 1)将要进行质谱分析的凝胶用超纯水清洗5min/次X5次； 2)根据所要分析的蛋白质点浓度及大小切去ΙΟΟΟμI Eppondorf枪头尖端,使用切好的枪头从上述凝胶中切取所要分析的蛋白质点放入1.5ml EP管中； 3)每管中加入100μ I超纯水,室温下利用摇床震荡洗漆15min,吸去超纯水；重复此步骤两次； 4)每管中加入100μ I胶内酶切脱色液，室温下利用摇床震荡脱色30min，吸去胶内酶切脱色液；重复此步骤4次至胶粒呈无色透明状； 5)每管中加入100μ I乙腈，室温下摇床震荡脱水lOmin，吸去乙腈； 6)抽真空干燥25min至胶粒呈白色颗粒状； 7)每管中加入10μ I酶液，置于4°C保持lh，吸去多余酶液； 8)将EP管倒置，37°C保持12-14h，使蛋白质进行完全酶切； 9)每管中加入30μ I肽段抽提液I，37°C保持lh，取上清液至新管内； 10)向含胶粒的EP管中加入30μ I肽段抽提液II，30°C保持lh，取上清液至步骤9中的含有上清液的管内； 11)将所得到的含有肽段的抽提液进行真空干燥Ih左右，至余液为10μI ; 12)将0.8 μ I肽段抽提液加到样品靶上，待样品干燥后重复加样一次； 13)在近干的样品上加0.5 μ I基质； 14)用Iμ I的1%。TFA洗液清洗靶位，保持30S ;重复两次； 15)待样品完全干燥后将样品板置于BrukerDaltonics Autoflex中进行分析,得到蛋白样品的肽质量指纹图，即酶解蛋白的所有肽段的质量分布图。
7.根据权利要求5所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于所述蛋白鉴定的具体操作过程为通过本地化的MASCOT软件在NCBInr20100116数据库中进行蛋白质检索，与数据库中已知的所有蛋白指纹进行匹配，设定参数为MaxMwassed Cleavages :1 ；Fixed Modifications ；CarboxymethyI (C) ；VaviableModifications 0xidation (M) ；Mass values :MH+、Monowasotopic ；Peptide MassTolerance : ±0. 2Da ;若鉴定结果得分大于85分，即P〈0. 05,说明搜索结果可信。
8.根据权利要求I所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤B之后进一步利用RT — PCR技术对所筛选出的抗旱候选基因进行验证。
9.根据权利要求I所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于步骤B之后进一步利用WesternBlot技术对所筛选出的抗旱候选基因进行验证。
10.根据权利要求1-9任一项所述的应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其特征在于所述植物为白芥。
全文摘要
本发明公开了应用蛋白质组学技术筛选植物抗旱相关候选基因的方法，其步骤包括A.分别取干旱处理组和正常浇水处理组植物植株叶片，首先利用双向凝胶电泳技术寻找差异蛋白，初步获取与植物抗旱相关的候选基因；B.再通过质谱鉴定技术对所得差异蛋白进行复筛，进一步筛选获取与植物抗旱相关的候选基因。本发明提供的筛选植物(尤其是白芥)抗旱相关候选基因的方法，能够有效克服现有技术筛选效率不高的问题。
文档编号G01N27/447GK102967643SQ201210438800
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者黄进勇, 黄依冰, 马盼盼 申请人:郑州大学
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