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专利名称：一种糖类过敏原的测定方法
一种糖类过敏原的测定方法技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的说，本发明描述了一种糖类过敏原的检测方法。
背景技术：
食物过敏是人们对食物产生IgE介导的I型变态反应，临床表现为荨麻疹、哮喘、腹痛和腹泻等多种症状，严重的可导致休克。一般来说，食物过敏原为分子量介于 10 70 kD之间的蛋白或糖蛋白。随着社会发展，人们饮食结构的变化，过敏发病率日益增高，给人们健康造成巨大威胁。在过敏反应中，90%以上是由蛋类、花生、乳类等八类食物所引起。目前对一些食品中过敏原的检测方法还很有限，主要有基于一些过敏原的免疫反应来检测。但是这个方法存在成本高，此外对于一些过敏原来说，相应的抗体或抗原难以得到，因而也阻碍了免疫检测技术在过敏原检测中的应用。发明内容
技术问题本发明针对上述技术问题，提供一种氧化锌量子点标记糖类过敏原的溶出伏安法检测芯片，该方法利用氧化锌标记糖类过敏原检测低浓度糖类过敏原，对相应糖类过敏原的检测限低、选择性好、灵敏度高、稳定性好。
技术方案在本发明的糖类过敏原的测定方法，利用氧化锌量子点标记糖类过敏原；同时在电解池中的芯片上固定化一层凝集素，在一系列已知浓度的待测糖类过敏原溶液中，使标记了氧化锌量子点的糖类过敏原和芯片上的凝集素进行特异性结合，把标记在糖类过敏原上的氧化锌量子点连接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化锌量子点溶解为锌离子，用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立锌离子浓度与糖类过敏原浓度之间的关系，从而确定待测糖类过敏原浓度。
具体测定方法为a.将0.5 5毫克氧化锌量子点分散到50 200微升1纳克/毫升的糖类过敏原溶液中，在室温下震荡lOmin，离心，用pH值为6. 8^7. 5的磷酸盐缓冲溶液清洗三次。再加500 μ L Γ2% w/v牛血清蛋白，15 35°C下震荡l(T30min，离心，用pH值为6. 8 7. 5的磷酸盐缓冲溶液清洗三次；最终分散于5(Γ150 μ L 0.05 0.1% ν/ν曲拉通Χ_100磷酸缓冲溶液，不用时保存于冰箱保温层；b.将二氧化硅片或玻璃片分别在丙酮、乙醇和水中分别超声5min，然后在6(Γ80° C 的ΝΗ40Η/Η202 /H2O 1:1:5 7，ν/ν和HC1/H202/H20 1 1 4 6，ν/ν分别浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干净，晾干；然后放入5%ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2飞h， 洗干净、晾干，再放入l(Tl5mL含广2°如八戊二醛？!1值为6.8 7.5的磷酸盐缓冲溶液，于 4°C静置纩12 h，随后用去离子水清洗、晾干，待用；c.将修饰后的芯片安装在一个孔径小于芯片边长的电解池中，将50μ L含1 2 mg/ HiL凝集素PH值为6.纩7. 5的磷酸盐缓冲溶液滴在上述处理好的芯片上，并于4°C静置纩12 h,随后用去离子水清洗；然后将上述芯片用含0.5 1% w/v牛血清蛋白和0.05 ^0. 1% ν/ν吐温-20浸泡0. 5^1 h,随后用去离子水清洗、待用；d.将处理好的待测样品滴在制备好的芯片上，放置15飞Omin，用去离子水清洗芯片表面3次；e.向电解池中注入pH值为广3的盐酸溶液溶解芯片上的氧化锌量子点，并用pH值为 Γ3盐酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH值为6. 8^7. 5的磷酸盐缓冲溶液至广3毫升；f.用钼电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电极，-0.8^-1. 5伏富集9(Γ150秒，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在-1. 1伏；g.改变第1步糖类过敏原浓度，重复第e、f、g步，测定一系列糖类过敏原浓度相对应的锌的溶出伏安峰的峰值电流，建立峰值电流与糖类过敏原浓度之间的对应关系。
所述芯片为二氧化硅片或玻璃片。
以上过程测得的锌的溶出伏安峰值电流与糖类过敏原浓度之间的对应关系是本发明方法的重要的基础数据，为用此发明方法进行实际临床检测提供浓度判定的理论依据，对利用本发明方法进行快速、准确的临床检测有着极其重要的意义。
上述凝集素与糖类过敏原为刀豆凝集素及其鸡卵粘蛋白。
上述芯片为二氧化硅片或玻璃片。
有益效果与现有技术相比，本发明具有以下优点1，本发明氧化锌量子点对糖类过敏原的标记过程与溶出过程，操作简单，条件温和，量子点与糖类过敏原的结合稳定牢固。非常有利于保持糖类过敏原的生物活性。
2，本发明运用溶出伏安法测锌离子浓度，易于锌在汞电极上的富集，锌的溶出峰易测且峰值电流强，易于建立准确的峰值电流与糖类过敏原浓度之间的曲线关系。有利于降低糖类过敏原检测的检测限，提高检测灵敏度。使快速准确检测低浓度糖类过敏原成为可能。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是过敏原检测芯片组装示意图。
图2是标准样品的过敏原芯片检测结果。
具体实施方式
(如图1)1，将0. 5毫克氧化锌量子点分散到50微升1纳克/毫升的鸡卵粘蛋白溶液中，在室温下震荡lOmin，离心，用pH值为7. O的磷酸盐缓冲溶液清洗三次。再加500 μ L 1% (w/v) 牛血清蛋白，室温下震荡lOmin，离心，用pH值为7. O的磷酸盐缓冲溶液清洗三次。最终分散于50 μ L 0. 1% (ν/ν)曲拉通X-IOO pH值为7. O的磷酸盐缓冲溶液，不用时保存于冰箱保温层。
2，芯片修饰，硅片(1x1x0. 2mm)分别在丙酮、乙醇和水中分别超声5min，然后在80° C 的 NH40H/H202 /H2O (1 1 7，ν/ν)和 HC1/H202/H20 (1 1 6，ν/ν)分别浸泡 IOmin0 拿出后用清水洗干净，晾干。然后放入5%(ν/ν)3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡5 h， 洗干净、晾干，再放入含有洲(v/V)戊二醛PH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，于4°C静置12 h，随后用去离子水清洗、晾干，待用。
3，检测芯片制备，将修饰后的安装在一个孔径小于芯片边长的电解池中，将50 yL含有1 mg/mL刀豆凝集素pH值为7. 0的磷酸盐缓冲溶液滴在上述处理好的芯片上， 并于4°C静置12 h,随后用去离子水清洗。然后将上述芯片用含1% (w/v)牛血清蛋白和 0.05 % ( ν/ν)吐温-20浸泡1 h，随后用去离子水清洗、待用。
4，检测方法，将处理好的鸡卵粘蛋白样品滴在制备好的刀豆凝集素芯片上，放置 15min,用去离子水清洗芯片表面3次。
5，向电解池中注入1800 μ L pH值为2的盐酸溶液超声IOmin以溶解芯片上的氧化锌量子点，随后上如溶液转移到电解池并依次加入2000 μ L PH值为7. 01的磷酸盐缓冲溶液，4uL 10 ppm硝酸汞(II)。50 μ L氢氧化钠溶液(0.32 Μ)。然后用电化学检测，6，用钼电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电极，-1.3 V电富集2 min，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在-1. 1伏。
7，改变第1步鸡卵粘蛋白浓度，重复第4、5、6步，测定一系列鸡卵粘蛋白浓度相对应的锌的溶出伏安峰的峰值电流，建立峰值电流与鸡卵粘蛋白浓度之间的对应关系(图2)。权利要求
1.一种糖类过敏原的测定方法，其特征在于利用氧化锌量子点标记糖类过敏原；同时在电解池中的芯片上固定化一层凝集素，在一系列已知浓度的待测糖类过敏原溶液中，使标记了氧化锌量子点的糖类过敏原和芯片上的凝集素进行特异性结合，把标记在糖类过敏原上的氧化锌量子点连接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化锌量子点溶解为锌离子，用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立锌离子浓度与糖类过敏原浓度之间的关系，从而确定待测糖类过敏原浓度。
2.根据权利要求1所述的糖类过敏原的测定方法，其特征在于具体测定方法为a.将0.5 5毫克氧化锌量子点分散到50 200微升1纳克/毫升的糖类过敏原溶液中，在室温下震荡lOmin，离心，用pH值为6. 8 7. 5的磷酸盐缓冲溶液清洗三次。再加 500 μ Ll 2% w/v牛血清蛋白，15 下震荡10 30min，离心，用pH值为6. 8 7. 5 的磷酸盐缓冲溶液清洗三次；最终分散于50 150 μ L 0. 05 0. (ν/ν)曲拉通Χ-100 磷酸缓冲溶液，不用时保存于冰箱保温层；b.将二氧化硅片或玻璃片分别在丙酮、乙醇和水中分别超声5min，然后在60 80°C的 ΝΗ40Η/Η202/Η20 1:1: 5 7，ν/ν 禾口 HC1/H202/H20 1:1: 4 6，ν/ν 分另Ij浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干净，晾干；然后放入5% ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2 5h，洗干净、晾干，再放入10 15mL含1 2% ν/ν戊二醛pH值为6. 8 7. 5 的磷酸盐缓冲溶液，于4°C静置8 12h，随后用去离子水清洗、晾干，待用；c.将修饰后的芯片安装在一个孔径小于芯片边长的电解池中，将50μ L含1 ang/mL 凝集素PH值为6. 8 7. 5的磷酸盐缓冲溶液滴在上述处理好的芯片上，并于4°C静置8 12h，随后用去离子水清洗；然后将上述芯片用含0. 5 1 % w/v牛血清蛋白和0. 05 0. 1 % ν/ν吐温-20浸泡0. 5 lh，随后用去离子水清洗、待用；d.将处理好的待测样品滴在制备好的芯片上，放置15 50min，用去离子水清洗芯片表面3次；e.向电解池中注入pH值为1 3的盐酸溶液溶解芯片上的氧化锌量子点，并用pH值为1 3盐酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH值为6. 8 7. 5的磷酸盐缓冲溶液至 1 3毫升；f.用钼电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电极，-0.8 -1.5 伏富集90 150秒，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在-1. 1伏；g.改变第1步糖类过敏原浓度，重复第e、f、g步，测定一系列糖类过敏原浓度相对应的锌的溶出伏安峰的峰值电流，建立峰值电流与糖类过敏原浓度之间的对应关系。
3.根据权利要求2所述的氧化锌量子点标记糖类过敏原的溶出伏安测定方法，其特征在于所述芯片为二氧化硅片或玻璃片。
全文摘要
本发明是一种糖类过敏原的测定方法，利用氧化锌量子点标记糖类过敏原；同时在电解池中的芯片上固定化一层凝集素，在一系列已知浓度的待测糖类过敏原溶液中，使标记了氧化锌量子点的糖类过敏原和芯片上的凝集素进行特异性结合，把标记在糖类过敏原上的氧化锌量子点连接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化锌量子点溶解为锌离子，用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立锌离子浓度与糖类过敏原浓度之间的关系，从而确定待测糖类过敏原浓度。
文档编号G01N27/48GK102520163SQ20111036483
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者徐春祥, 杨池, 王明亮 申请人:东南大学