专利名称：质量标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于标记分析物(具体是生物分子如核酸和蛋白质)的有用的化合物。具体而言，本发明涉及采用质谱法使用特殊的质量标记物进行分析的方法。
背景技术：
标记感兴趣的分子的各种方法在本领域中是已知的，包括放射性原子、荧光染料、发光试剂、电子俘获剂和光吸收染料。这些标记系统的每ー种都具有使其适合于某些应用而非其它应用的特征。由于安全原因，对非放射性标记系统的兴趣已导致荧光标记方案的 广泛的商业发展，尤其是用于遗传分析的荧光标记。荧光标记方案使得相对少量的分子能同时进行标记，通�？赏笔褂�4种标记物，也可能达到8种。但是，检测装置的成本和分析所产生的信号的难度限制了可在荧光检测方案中同时使用的标记物的数量。最近，在质谱法领域中已开发了一种检测可断裂地连接于它们相关的感兴趣分子的标记物的方法。在许多分子生物学应用中，人们需要能在分析之前分离出感兴趣的分子。通常进行液相分离。近年来，质谱法已发展了许多用于液相分离的界面，这使得质谱法可特别有效地用作这些应用的检测系统。直到最近才采用液相色谱质谱法直接检测分析物离子或它们的片段离子。但是，对于许多应用，如核酸分析，分析物的结构可从间接的标记而得以确定。这尤其对于采用质谱法是有利的，因为复杂的生物分子(如DNA)具有复杂的质谱，并且其检测具有相对差的敏感性。间接检测指可使用相关的标记物分子来鉴别原始的分析物，该标记物被设计用于敏感性检测，并具有简单的质谱。简单的质谱使得可同时使用多种标记物分析大量的分析物。PCT/GB98/00127描述了共价连接于可断裂的标记物的核酸探针的阵列，所述标记物可采用质谱法检测到，该方法可鉴别共价连接的核酸探针的序列。此申请中的标记的探针具有Nu-L-M的结构，其中Nu是共价连接于L的核酸，L是可断裂的连接物，它共价连接于M，M是质量标记物。在此应用中，较佳的可断裂的连接物在质谱仪的离子源中断裂。此申请公开了多种离子化方法和使用四极质量分析仪、飞行时间(Time of flight,T0F)分析仪和磁性扇形场仪器进行的分析，将它们作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/GB94/01675公开了可断裂地连接于质量标记分子的配体和特殊的核酸。较佳的可断裂连接物是光可断裂的。此申请公开了基质辅助的激光解吸电离(MALDI)TOF质谱法作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/US97/22639公开了可释放的非挥发性质量标记物分子。在优选的实施方式中，这些标记物含有聚合物，通常是生物聚合物，这些聚合物可断裂地连接于反应性基团或配体(即探针)。优选的可断裂的连接物似乎在化学上和酶学上是可断裂的。此申请公开了 MALDI TOF质谱法作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。PCT/US97/01070、PCT/US97/01046 和 PCT/US97/01304 公开了可断裂地连接于质量标记分子的配体和特殊的核酸。较佳的可断裂的连接物似乎是化学可断裂的或光可断裂的。这些申请公开了许多离子 化方法和使用四极质量分析仪、TOF分析仪和扇形磁场仪器进行的分析，将它们作为采用质谱法分析质量标记物的特殊方法。分析物材料所产生的质谱对污染物非常敏感。基本上，可电离的导入质谱仪中的任何材料都将出现在质谱中。这意味着对于许多分析，需要在将分析物导入质谱仪前进行小心地纯化。对于高通量系统，为了通过使用质量标记物对分析物进行间接分析的目的，需要避免任何不需的样品制备步骤。即，需要能检测污染材料背景中的标记物，并能确定所检测到的峰事实上与标记物相符。现有的技术没有公开在以检测系统为基础的质谱法中改进信噪比的方法或组合物，或者可提供证明谱中由质量标记物的存在引起的质量峰的方法或组合物。为了在液相层析或电泳分离后检测分析物，需要使所使用的标记物对分离过程产生的干扰最小。如果使用这类分析物的阵列，则需要阵列中的各个成员对与它们连相关的分析物的影响与其它标记物相同。这在某种程度上与质量标记的意图有抵触，这种意图产生基于其质量在质谱仪中可分解的标记物阵列。质量标记物较佳应可被分解成4道尔顿，以防止一种标记物的同位素峰受到其它标记物的同位素峰的干扰。这意味着为了产生250个不同的质量标记物，可能需要标记物的范围扩展到约1000道尔顿，可能还更多，因为重要的是产生被4道尔顿精确分离的大阵列的标记物。这个质量范围质量将几乎肯定会产生对采用质谱法进行检测的任何分离过程产生不同影响的质量标记物。这对仪器设计也有关系，因为随着质量范围的增加超过了质谱仪可检测离子的范围，仪器的成本也増加。
发明内容
因此，本发明的ー个目的是解决与上述现有技术相关的问题，并提供在污染背景中可检测到的质量标记物，以及作为质量标记物的身份可被证实的标记物。此外，本发明的ー个目的是提供在压缩的质量范围内可被分解的标记物的阵列，这样这些标记物不会对分离过程有太多干扰，以及提供在质荷比的有限范围内检测离子的质谱仪中可容易地被检测到的标记物的阵列。本发明还有ー个目的是提供分析生物分子的方法，该方法利用本发明的标记物使通量、信噪比和这些检测的敏感性最大化，具体是在遗传分析中，更具体是用在分析蛋白质的双向凝胶电泳中。此外，下面公开的质量标记物的设计使得为检测质量标记物的目的而设计出ー种简易的串联质谱仪。第一质量分析仪仅仅需要选择有限量的其质量相对低的离子。第二质量分析仪仅仅需要检测少量的断裂产物。因此，本发明提供一组两个或多个质量标记物，组中的各个标记物含有通过可断裂的连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，此部分具有抗碎裂性，其中，组中各标记物的聚集质量(aggregate mass)可相同或不同，并且,组中各标记物的质量指示部分的质量可相同或不同，其中，在组中具有共同质量的质量指示部分的任何类的标记物中，各标记物具有不同于该类中所有其它标记物的聚集质量，并且，在组中具有共同聚集质量的任何类的标记物中，各标记物具有其质量不同于该类中所有其它质量指示部分的质量的质量指示部分，这样，采用质谱法分析时组中所有的质量标记物都可互相区分。术语“质量指示部分”在本文中指采用质谱法检测到的部分，而术语“质量归ー化部分”在本文中指采用质谱法不一定能检测到的部分，但是它的存在确保了质量标记物具有所需的聚集质量。组中标记物的数量并没有特殊的限制，但条件是该组含有许多的标记物。但是，组中含有两种以上、三种以上、四种以上或五种以上的标记物较佳。
本发明还提供质量标记物的阵列，该阵列含有两组以上上述阵列标记物，其中，任ー组中各质量标记物的聚集质量与阵列中其它组中的每个质量标记物的聚集质量不同。本发明还提供ー种分析方法，该方法包括采用质谱法鉴别不同于分析物的质量标记物或其组合，从而检测分析物，其中，质量标记物是上述的标记物组或其阵列中的质量标记物。
现在，本发明将结合附图仅采用举例方式作更详细的描述，其中图I显示三重四极质谱仪的示意性布局图；图2显示形成本发明的标记物组的10个片段，包括5个质量归ー化部分(Mtl-M4)和5个质量指示部分(XcrX4)，其中，将氟原子取代基用作质量调节部分；图3显示本发明ー组5个标记物，由图2的质量归一化部分和质量指示部分形成；图4显示本发明ー组5个质量标记物,其中,所有的标记物的质量不同,但该组中所有的质量指示物具有相同的质量；图5显示标记分析物(如寡核苷酸与质量标记物结合)的例子，这样，质量标记物的结合具有唯一的可鉴别分析物的质谱；图6显示成组的质量标记物的阵列，各组具有相同质量系列的修饰基团(S)，并且，由于其基底苯基上的氟取代基的数量的缘故，各组互不相同；图7显示成组的质量标记物的阵列，各组具有相同质量系列的修饰基团(S)，并且，由于质量系列修饰基团中苯基醚的数量的缘故，各组互不相同；图8阐述了本发明的“混合模式”实施方式，该图显示了当存在O或I的相对量吋，三种标记物P、Q和R的所有组合的8种可能的唯一质谱中的4种；图9阐述本发明的“混合模式”实施方式，该图显示了当存在0、1或2的相对量吋，三种标记物P、Q、R、S和T的所有组合的243种可能的唯一质谱中的8种(如果T维持恒定，作为内部标准，则有81种可能的质谱)；图10显示通过扩大质量归一化部分和质量指示部分，以允许进行更大范围的取代而可形成的标记物组有多大——这组标记物有9个成员，以及用氟原子取代基作为质量调节部分而形成的标记物组有多大——这组标记物至少有8个成员，这便于采用本发明的混合模式对寡核苷酸阵列中的256个四聚体进行标记；图11显示质谱1，这是个含有从所有的离子A+、B+、C+和D+的峰的完整的质谱；图12显示质谱2，这个质谱仅仅是A+的质谱，通过在质谱仪的第一四极(Ql)中选择A+离子而产生的质谱；图13显示质谱3，这是第一离子A1+(与A+具有相同的质荷比)和A1+. P+和Q+的断裂产物的质谱；图14显示质谱4，这是第二离子A2+(与A+具有相同的质荷比)和A2+、X+和Y+的断裂产物的质谱；图15显示质谱5，当两类这样的离子(A1+和A2+)存在时，选择A+离子而形成的质谱；图16显示质谱6，这是个在质谱仪的三极矩中形成的谱，当两类在Q2中通过碰撞诱导了所选择离子的解离的这样的离子(A1+和A2+)存在时，在Ql中选择A+离子，在Q3中选择已知的撞击产物A1+ (P+)——这种方法可使A1+和A2+分解；图17显示质谱7，这是本发明ー组5种质量标记物的ニ维谱，其中，在Ql (第一維)中选择质量MX，在Q3 (第二维)中选择5种不同的质量X。、X1, X2、X3和X4 ；图18显示质谱8，这是本发明ー组4种质量标记物的ニ维谱，其中，在Ql (第一維) 中选择4种不同的质量MqXq、M1X0, M2X0和M3Xtl,在Q3 (第二维)中选择单ー质量M。；图19显示质谱9,这是含有由Mci-M3和Xci-X3的所有组合形成的标记物的一组质量标记物的ニ维谱，其中，在Ql(第一維)中选择7种不同的质量，在Q3(第二維)中选择4种不同的质量Xci-X3 ；图20显示使用本发明的质量标记物进行典型的断裂过程的示意图，本发明的质量标记物与它们的分析物发生热断裂，或者使用电喷射离子化使它们断裂；图21显示使用本发明的ー组5个质量标记物在ニ维质谱中进行选择的示意图。图22显示本发明的氘化的质量标记物；图23显示本发明的进ー步氣化的质量标记物；图24显示具有H2N-gly-leu-ala-ser-glu_C00H序列的两条肽样品的理论谱,各样品与图23中的式子所述的ー种标记物连接。
具体实施例方式在ー个较佳实施方式中，本发明提供上述ー组质量标记物，其中，组中各标记物具有有共同质量的质量指示部分，并且组中各标记物具有唯一的聚集质量。这种第一类型的标记物组的例子在图4中给出。在另一可选择的更佳的实施方式中，组中各标记物具有共同的聚集质量，并且组中各标记物具有有唯一质量的质量指示部分。这种第二类型的标记物组的例子在图3中给出。该组标记物并不受到上述两个较佳实施方式的限制，可包括如两种类型的标记物，但条件是，如上所述，所有的标记物通过质谱法分析都是可区分的。较佳的是，在第二类型的标记物组中，组中各质量指示部分具有共同的基本结构，组中各质量归一化部分具有共同的基本结构，并且组中各质量标记物含有一个或多个质量调节部分，该质量调节部分被连接于质量指示部分和/或质量归一化部分的基本结构上或者位于这些结构之中。在这个实施方式中，组中姆一个质量指示部分含有不同数量的质量调节部分，组中每ー质量标记物具有相同数量的质量调节部分。在整篇说明书中，所述的“共同的基本结构”是指两个或多个部分共享有ー个结构，该结构具有基本上相同的结构构架、骨架或核心。这种构架或骨架可以是如苯基醚部分。该构架或骨架可含有与其侧接的取代基，或者用其中没有改变共同的基本结构的原子或同位素取代。通常，上述第二类型的标记物组含有具有下式的质量标记物M(A)y-L-X(A)z式中,M是质量归ー化部分,X是质量指示部分,A是质量调节部分，L是可断裂的连接物，y和z是O或O以上的整数，y+z是I或I以上的整数。较佳的是，M是抗碎裂性基团，L是在与其它分子或原子碰撞时易断裂的连接物，X较佳是预先电离的具有抗碎裂性的基团。M和X的质量总和与该组的所有成员相同。较佳的是，M和X具有相同的基本结构或核心结构，这种结构被质量调节部分修饰。该质量调节部分确保M和X的质量总和与组中所有的质量标记物相同，但保证了每个X具有不同的(唯一的)质量。具有上述结构的优选质量标记物组是其组中每种标记物具有下述结构的组
权利要求
1.一组两种或多种质量标记物，组中各标记物包含通过连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，所述连接物含有在质谱仪中可断裂的基团，其中，各质量归一化部分确保质量标记物具有所需的聚集质量，且组中各质量指示部分的质量相同，其中，组中各标记物具有与该组中的所有其它标记物不同的质量，并且，组中所有的质量标记物可通过质谱法得以相互区分。
2.如权利要求I所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述组中的各质量标记物具有下述结构 M (A) y-L_X (A) z 式中，M是质量归ー化部分，X是质量指示部分，A是质量调节部分，L是可断裂的连接物，y和z是O或O以上的整数，y+z是I或I以上的整数。
3.如权利要求2所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量调节部分选自 (a)位于所述质量指示部分和/或质量归一化部分的基本结构内的同位素取代基； (b)连接于所述质量指示部分和/或质量归一化部分的基本结构的取代基原子或基团。
4.如权利要求3所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量调节部分选自卤原子取代基、甲基和2H或13C同位素取代基。
5.如权利要求4所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量调节部分是氟原子取代基。
6.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物,其特征在于,将所述质量指示部分连接于所述质量归ー化部分的可断裂连接物是可通过碰撞而断裂的连接物。
7.如权利要求6所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述可断裂的连接物包含酰胺键。
8.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物，其特征在干，所述质量归ー化部分包含抗断裂基团。
9.如权利要求8所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量归ー化部分包含苯基。
10.如前述权利要求中任一项所述的ー组质量标记物,其特征在于,所述质量指示部分包含预电离的基团。
11.如权利要求10所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述质量指示部分包含N-甲基批淀基，或包含选自以下的基团_NH2、-NR2> -NR3+、-SR3+、-SO3、_P04、_P03、-CO2、
12.如权利要求2-11中任一项所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述组中各标记物具有下述结构
13.如权利要求12所述的ー组质量标记物，其特征在于，所述R是H，L是酰胺键，p=0，A是氟原子。
14.一组两种或多种探针，其特征在干，组中各探针不同，它们连接于独特的质量标记物或质量标记物的独特组合，所述质量标记物来自权利要求1-13中任一项所述的质量标记物组。
15.如权利要求14所述的探针组，其特征在于，所述各探针连接于质量标记物的独特组合，每种组合由该质量标记物组中每种质量标记物的存在与否得以区别，和/或由连接于该探针的各质量标记物的数量加以区別。
16.如权利要求14-15中任一项所述的探针组，其特征在于，所述各探针包含生物分子。
17.如权利要求16所述的探针组，其特征在于，所述生物分子选自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸碱基、蛋白质和/或氨基酸。
18.ー种分析方法，该方法包括，采用质谱法鉴别质量标记物或质量标记物的組合，从而同时检测两种或多种分析物，其中，所述质量标记物是权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组的质量标记物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在干，由来自质量标记物组的质量标记物的独特组合鉴别每种分析物，各种组合由所述组中的每种标记物的存在与否而得以区别，和/或由各质量标记物的数量而加以区別。
20.如权利要求18-19中任ー项所述的鉴别两种或多种分析物的方法，其特征在于，在采用质谱法检测质量标记物之前，先根据所述分析物的质量将它们分离。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，采用色谱法或电泳进行分离。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，用于检测质量标记物的质谱仪包括一个或多个质量分析仪，这些质量分析仪能使具有特定质量或质量范围的离子通过，以进行检测，和/或能使离子分解。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在干，使用质量分析仪选择对ー种或多种已知的质量标记物特异的具有特定质量或质量范围的离子，使所选择的离子分解，然后检测分解产物，以鉴别指示所选择的质量标记物的离子模型。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述质谱仪包括三个四极质量分析仪。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述第一质量分析仪用于选择具有特定质量或质量范围的离子，第二质量分析仪用于分解所选择的离子，第三个质量分析仪用于检测所产生的离子。
26.如权利要求18-25中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括 (a)使ー种或多种分析物与一组探针接触，其中，所述探针是权利要求14-17中任ー项所定义的探针； (b)通过检测与分析物相关的探针鉴别分析物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，在采用质谱法检测所述质量标记物前，先将质量标记物从所述探针上解离下来。
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述方法包括使ー种或多种核酸与ー组杂交探针接触。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述一组杂交探针是具有256个以内的四聚体的组，组中各探针具有不同的核酸碱基的组合。
30.如权利要求18所述的ニ维质谱分析法，其特征在于，该方法包括 (a)提供两种或多种分析物，各分析物用质量标记物或质量标记物的组合标记，其中，这些质量标记物来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组； (b)使所述质量标记物与所述分析物解离； (c)检测质量标记物； (d)在质谱仪中分解质量标记物，以从质量归ー化部分释放出质量指示部分； (e)检测质量指示部分； (f)在所述质量标记物的质谱和所述质量指示部分的质谱的基础上鉴别分析物。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，在所述(c)步骤中，选择具有选定的质量或质量范围的质量标记物用于检测，和/或在(e)步骤中，选择具有特定质量的质量指示部分用于检測。
32.如权利要求18所述的分析方法，其特征在于，该方法包括 (a)在分析物的第一特性的基础上，对标记的分析物的混合物进行第一分离处理； (b)在分析物的第二特性的基础上，对所得的分离分析物进行第二分离处理； (C)通过检测分析物的标记物，从而检测该分析物； 其中，这些分析物用来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组或阵列的质量标记物标记。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，在(a)步骤和/或(b)步骤中，根据所述分析物的长度或质量将它们分离。
34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，在(a)步骤和/或(b)步骤中，根据所述分析物的等电点将它们分离。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物包括蛋白质、多肽、肽、氨基酸或核酸，或者它们的片段。
36.如权利要求32-35中任一项所述的双向凝胶电泳法。
37.根据权利要求18所述的表征核酸的方法，其特征在于，该方法包括 (a)提供ー组核酸片段，各片段具有可断裂地连接于其上、用于鉴别该片段的特征的质量标记物，所述质量标记物来自权利要求1-13中任ー项所定义的质量标记物组的质量标记物；(b)在它们的长度的基础上分离这些片段； (C)解离各片段，使其释放出其质量标记物； (d)采用质谱法测定各质量标记物，以描述各片段的特征与片段长度的关系。
38.如权利要求37所述的方法，将该方法用于表征cDNA，其特征在于，它包括 (a)使含有ー组含ー种或多种cDNA或其片段的样品暴露于断裂剂中，该断裂剂识别预定的序列，并在距离预定序列已知偏移位置的基准位点上进行切割，从而产生ー组末端片段，所述预定序列接近各cDNA或其片段的一端； (b)将衔接子寡核苷酸连接于各基准位点上，该寡核苷酸含有样品断裂剂的识别位点； (C)将这组末端片段暴露于样品断裂剂中，该断裂剂与上述识别位点结合，并在距离该识别位点已知偏移位置的样品位点上进行切割，从而在各个末端片段中产生来自未知序列和预定长度达6个碱基的粘性末端序列； (d)根据序列的长度将该组末端片段分成亚组； (e)如下测定各粘性末端序列 (i)用标记的杂交探针阵列探測，该阵列含有所有可能的预定长度的碱基序列； ( )连接这些杂交到粘性末端序列上的探针； (iii)通过鉴别标记物，较佳是通过定量标记物，測定哪些探针被连接， 其中，这些标记物是来自权利要求1-13中任一项所述的组的质量标记物。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，采用毛细管电泳、HPLC或凝胶电泳分离末端片段组。
40.根据权利要求18所述的表征核酸的方法,其特征在于,该方法包括在至少ー种标记的末端碱基的存在下，从ー个或多个核酸模板中产生Sanger梯核酸片段，然后鉴别该片段的长度及其末端碱基，其中该标记物与该末端碱基是相关的，并且是来自权利要求1-13中任ー项所述的组中的质量标记物。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述所有四种末端碱基出现在相同的反应区中。
42.如权利要求40或41所述的方法，其特征在干，该方法包括从出现在相同反应区中的大量核酸模板中产生Sanger梯核酸片段，然后鉴别所产生的各核酸片段的长度、产生该片段的模板的种类以及该片段的末端碱基，其中，在产生这些片段之前，先使标记的引物核苷酸或寡核苷酸杂交到各模板上，各引物上的标记物对该引物所杂交的模板特异，从而允许鉴别该模板。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在干，鉴别模板的标记物是来自权利要求1-13中任一项所述的组的质量标记物。
44.根据权利要求18所述的核酸测序的方法，其特征在于，该方法包括 (a)获得靶核酸组，该组包含一条或多条将要测序的单链DNA，每条DNA以唯一的量存在，并具有一个引物，为核酸提供双链部分用于连接； (b)使核酸组与杂交探针阵列接触，各探针包含可断裂地连接于预定长度的已知碱基序列上的标记物，该阵列包含该预定长度的所有可能的碱基序列，这些碱基序列不能相互连接，其中，在连接酶的存在下，在使具有与位于各核酸的双链部分附近的单链核酸互补的碱基序列的探针与该双链部分连接的条件下，进行接触，从而形成延伸的双链部分，该部分不能与更多的探针连接； (C)除去所有未连接的探针；接着进行如下步骤 (d)解离连接的探针，释放出各标记物； (e)记录各标记物的数量； (f)激活延伸的双链部分，使能够在其上进行连接； 其中 (g)步骤(b)到(f)作为ー轮循环，重复进行足够多次，以通过测定释放的各标记物的序列来测定单链核酸或各单链核酸的序列； 其中，杂交探针的标记物是来自权利要求1-13中任一项所述的组或阵列中的各标记物。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述杂交探针是ー组256个四聚体，组中各探针具有不同组合的核酸碱基。
46.根据权利要求18所述的表征含有肽、多肽和/或蛋白质的样品的方法，其特征在于，该方法包括 (a)提供含有肽、多肽和/或蛋白质的样品，每种肽、多肽和/或蛋白质具有可断裂地连接于其上的质量标记物或质量标记物的组合，所述质量标记物来自权利要求1-13中任一项所述的组的质量标记物，其中，各肽、多肽和/或蛋白质与其标记物或标记物组合相关； (b)分析这些标记的肽、多肽和/或蛋白质，以检测所述标记物。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，通过断裂剂对含有多肽和/或蛋白质的样品的作用形成肽，由此提供所述样品。
48.如权利要求46或47所述的方法，其特征在于，在进行分析前，先采用色谱法或电泳分离所述标记的肽、多肽和/或蛋白质。
49.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其特征在于，提供多份样品。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，在进行分析前，先将所述多份样品集中。
51.如权利要求46-50中任一项所述的方法,其特征在于,所述样品中的ー种或多种肽 多肽和/或蛋白质经过了翻译后修饰，含有碳水化合物，并且，该方法包括，通过碳水化合物的羰基连接生物素，使修饰的肽、多肽或蛋白质进行生物素化。
52.如权利要求46-50中任一项所述的方法,其特征在于,所述样品中的ー种或多种肽、多肽和/或蛋白质经由酪氨酸磷酸化作用而被翻译后修饰，且该方法包括，采用亲和层析法，使用抗磷酸酪氨酸抗体分离这些修饰的肽、多肽和/或蛋白质。
53.如权利要求46-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括，从各肽、多肽和/或蛋白质中分离出单一的肽片段。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述各分离的片段是末端片段。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (a)用断裂剂处理含有一组含许多多肽的样品，已知该断裂剂识别多肽链中的特殊氨基酸残基或序列，以在切割位点进行解离，从而将该组多肽解离，产生肽片段； (b)从其所片段化的样品中分离出ー组肽片段，这些片段具有作为參考末端的多肽的N末端或C末端，每条肽在另一端在接近该參考末端处具有切割位点；(c)在分离这些肽片段之前或之后，用来自权利要求1-13中任一项所述的质量标记物组的质量标记物或质量标记物的组合标记多肽的姆ー个參考末端，其中，各參考末端与它的标记物或标记物的组合相关； (d)采用质谱法測定一条或多条分离的片段的特征序列，所述特征序列是从切割位点开始有预定数量的氨基酸残基的序列；其中，特征序列表征了各多肽。
56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (a)使含有一条或多条多肽的样品与第一断裂剂接触，产生多肽片段； (b)分离出一条或多条多肽片段，各片段含有片段化样品的多肽的N末端或C末端； (c)在分离多肽片段之前或之后，用来自权利要求1-13中任一项所述的质量标记物组的质量标记物或质量标记物的组合标记多肽的姆ー个末端，其中，各末端与它的标记物或标记物的组合相关； (d)采用质谱法鉴别分离的片段； (e)使用第二种断裂剂，对该样品重复上述步骤(a)-(d)，所述第二种断裂剂在与第一断裂剂作用位点不同的位点上解离； (f)由步骤(d)和(e)中鉴别得到的片段表征上述样品中的一条或多条多肽。
57.权利要求1-13中任一项所述的标记物组中的两种或多种质量标记物在分析方法中的应用。
58.如权利要求57所述的应用，其特征在于，所述应用是在双向电泳分析中。
59.如权利要求57所述的应用，其特征在于，所述应用是在ニ维质谱分析中。
60.如权利要求57-59中任ー项所述的应用，其特征在于，所述应用是在对ー个或多个核酸的测序方法中。
61.如权利要求57-59中任ー项所述的应用，其特征在于，所述应用是在基因表达描述法中。
62.如权利要求57-59中任ー项所述的应用，其特征在于，所述应用是在蛋白质表达描述法中。
63.如权利要求57-59中任ー项所述的应用，其特征在于，所述应用是在核酸分类的方法中。
全文摘要
提供了一组两种或多种质量标记物，组中各质量标记物包含通过可断裂的连接物连接于质量归一化部分的质量指示部分，该质量指示部分具有抗碎裂性，其中，组中各标记物的聚集质量可以相同或不同，组中各标记物的质量指示部分的质量可相同或不同，其中，在组中具有共同质量的质量指示部分的标记物的任何组合中，各标记物具有与该组合中的所有其它标记物不同的聚集质量，并且，在组中具有共同的聚集质量的标记物的任何组合中，各标记物具有其质量不同于该组合中所有其它质量指示部分的质量的质量指示部分，这样组中所有的质量标记物可由质谱法得以相互区分。
文档编号G01N33/58GK102839213SQ20121028532
公开日2012年12月26日 申请日期2001年3月14日 优先权日2000年3月14日
发明者G·施密斯, A·H·托马斯, R·A·W·约翰斯通 申请人:电泳有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
