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专利名称：检测链霉素药物残留的胶体金试纸卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体涉及一 种检测试纸卡。
背景技术：
链霉素(Streptomycin)是氨基糖甙类抗生素，被广范应用于动 物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒性，能选择性的损害 第8对脑神经，导致前庭和耳蜗神经损伤。肾毒性主要表现为近端 肾曲管损伤，出现蛋白尿、血尿、肾功能减退等，婴儿对氨基糖甙 类抗生素敏感，氨基糖甙类抗生素能透过胎盘损害胎儿听觉，毒副 作用和容易产成的耐药性。在动物食品中的残留会影响人类健康， 欧美国家及我国均要求其限量使用。
目前链霉素残留常用的检测方法有两种。 一种是色谱分析，如气 相色谱法(GC)，由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程，不适合现场监 控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法 (ELISA)。它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位 推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。

实用新型内容
本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种敏感度高、成本 低、操作简单、检测时间短的试纸卡。
本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样 品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，与常规试纸卡不同的是， 其中的结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域
覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一至三分之一区 域覆盖于样品吸收垫之下。
这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰 成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
所述反应膜上分别包被有链霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线 印迹"I "和包被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹"I "。从而可以用于链霉素残留的检测。
本实用新型试纸卡的底板为可PVC板或者是其它硬质而不吸水的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜；样品吸收垫可由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放 垫层包被有抗体-胶体金结合物。在样品吸收垫与结合物释放垫及吸水层上覆盖有保护膜，在玻璃棉和纤维层一侧约0.4cm处喷制样品标 记线。
偶联链霉素载体蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线印�：椭士叵叩亩哉沼〖Ｗ楹吓帕锌晌�"II"
本实用新型试纸卡具有如下有益效果
l.特异性强，敏感度高。链霉素快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆特异性和亲和力影响很�。�且具有较高的标记率。因此，快速检测纸卡具有较高的特异性和敏感性。可检测10ng/ml。
2.操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴(约IOO微升)，加后计时，5~8min内观察结果。
3.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线色 "I "及"II ，，印迹作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线"I "印迹表示在被检测样品液中含有链霉素，两条红线"ll"印迹表示在被检测样品中不含链霉素，结果判定形象、直观、准 确、简单明了，不容易出现阴性和假阳性误判。
4. 成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及 其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
5. 易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，人人都操作， 能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、 质量监测、动物产品加工、集化养殖到个体养殖等，具有广阔的巿场 前景和较大的经济、社会效益。


图l为链霉素快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸收垫; 2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线； 7、底板；
图2为链霉素快速检测试纸卡俯视结构示意图，其中8-l和8-2是 覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线；
图3为链霉素快速检测试纸卡阴性(图3,a)、阳性(图3.b)、无效 (图3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。
具体实施方式
实施例l试纸卡的组装
参见图l、图2:样品吸收垫l用玻璃棉制成，结合物释放垫层2 为吸附有链霉素的金标载体蛋白标记物的纤维层，根据可按下面制备 方法，制备包被有链霉素金标抗体纤维层，简称链霉素胶体金标记物， 3为反应膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，4吸水垫为吸水材料层 制成，5为检测区包被有链霉素-载体蛋白偶联物，6为质控区包被有 羊抗鼠IgG构成指质控线，7为PVC背衬为支持层，用塑料薄片条制成， 在PVC背衬上按顺序粘附硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫和样 本垫，将样本垫覆盖在结合物释放垫三分之一处，8-l为白色保护膜， 覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上，在样品吸收垫和结合物释放垫
交界处对应保护膜8-l位置偏向于样品吸收垫一方0.5cm处印有标记线9, 9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4即为吸水层(手柄端) 上覆盖有浅蓝色保护膜8-2。
要制成链霉素快速检测试纸卡首先需制备偶联链霉素载体蛋白， 制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体纤维，其次须制备羊抗鼠IgG抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法
1. 链霉素载体蛋白的偶联
取EDC50mg,用pH8.0的10mmoL/L PBS液1.5mL使之充分溶解(I液)。取链霉素58mg，用双蒸水2mL溶液(II液)。取OVA48mg，溶于3mL10mmoL/LPBS ( pH8.0 )液中(III液)。将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5mL)。室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液。4度搅拌12小时。静置10小时(4度)。用蒸馏水使之充分透析(约48小时)。
1.2链霉素-载体偶联物的鉴定
将载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明链霉素与载体蛋白偶联成功。
2. 抗链霉素克隆抗体的制备
2.1动物免疫
将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80μg/只，使其产生多克隆抗体。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1 比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，釆用间接竟争ELISA法测定细胞上 清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直接到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2细胞冻存和复苏
将链霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成lxl()S个/ml的细 胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37。C水 浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 2.3单克隆抗体的制备与纯化
将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射链 霉素的单克隆杂交瘤细胞株5><105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20'C环境保存。
3.链霉素金标抗体和金标标记物的制备
3.1胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置磁力加热棒搅拌 器上搅拌煮沸，每100ml0.01。/。氯金酸加入2mlP/。柠檬酸三钠，继续 煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的 胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。 链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按 1 2ing/ml抗体胶体金加入抗体链霉素抗体，继续搅拌混匀30min，加 入10%BSA至终浓度为1%，静置30min。 12000rpm、 4。C离心30min, 弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的 复溶缓冲液将沉淀重悬，置4'C备用，保存60天。
复溶缓冲液用含牛血清白蛋白(BSA) 0.02 0.1%,吐温-20 0,05 0.2%， PVP-300吡唂烷酮0.3。/。， 0.02MpH9.0的硼酸复溶缓冲 液。
4羊抗鼠IgG抗体的制备
羊抗鼠抗抗体的制备以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫 原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
5.链霉素快速检测试纸卡实施检测原理
当链霉素检测试纸卡样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶液通过金标抗体棉中的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗入滤纸中， 扩散过程中检测链霉素可与金标抗体相结合，进而封闭金抗体上链霉 素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上偶联链霉素载体蛋白的检 测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体 结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹"|"，呈一条印迹为阳 性，相反样本溶液中无链霉素则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联 链霉素的载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹"|"，同样
羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹"|"， 形成两条红线"||"阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示， 则试纸卡无效。
6.链霉素快速检测试纸卡检测实施列操作方法
6.1样本前处理
动物组织(鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝)样本称取1.0士0.05g匀质 过的组织样本于离心管中，加入4mlPB缓冲液，盖紧瓶盖在微沸的水 洛锅中水洛10min,取出后静置回至室温后，取100微升进行点样检 测。检测限为40ng/g。
尿液样本处理
蜂蜜样本称取lg蜂蜜样品，加入0.02M的PB缓冲液4ml， 进行溶解，取100微升进行点样检测。检测限为40ng/g。
6.2用试纸卡检测
将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加后计时，5 8min内 观察结果。超过10min样品检测判读无效。
6.3检测结果分析
链霉素在样品中浓度高于40ng/g时，胶体金标记的链霉素抗体 抗体与链霉素全部结合，从而在检测区内因为竟争反应不会与链霉素 偶联物结合而不出现红色条带。阴性样品在检测过程中由于缺少抗体 抗原竟争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条带。
阳性；当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，快速检测
试纸卡以显示红线色"1"，判为阳性，如图3中间图所示。
阴性当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红
色条带，且检测区颜色接近或浅于质控区时，快速检测试纸卡以显示
红线色为"11"，判为阴性，如图3左图所示。
无效当质控区不显示出红色条带，则无论检测区显示出红色条
带与否，该试纸卡判为无效，如图3右图所示。
权利要求1.一种检测链霉素药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
2、 如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于，结合物释放垫的 三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
3、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述反应膜 上具有包被有链霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹"I "和包 被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹"I "。
4、 如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，所述的检测线与 质控线平行。
5、 如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，检测线位于距离 结合物释放垫一侧0.4cm处。
6、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，在试纸卡的 两端分别覆盖有保护膜。
7、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为 PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
8、 如权利要求l或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的样品 吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成。
9、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合 物释垫层由纤维制成。
10、 如权利要求l或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合 物释放垫层包被有抗体-胶体金结合物。
专利摘要本实用新型提供了一种检测试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜层上具备包被有链霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成指质控线；结合物释放垫包被有链霉素的胶体金标记物。采用本实用新型试纸卡是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
文档编号G01N33/558GK201181296SQ200820078838
公开日2009年1月14日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者万宇平, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 吴小平, 亮 朱, 汪善良, 沈建忠, 赵正苗 申请人:北京望尔生物技术有限公司;北京望尔康泰生物技术有限公司