专利名称：检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹ELISA方法及其试剂盒及应用的制作方法
检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹 ELISA方法及其试剂盒及应用技术领域
本发明所属的领域为植物保护领域，尤其涉及番茄番茄黄化曲叶病毒的 dot-ELISA和组织印迹ELISA快速检测方法及其检测试剂盒的开发应用。
背景技术：
番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)导致番爺叶片上卷或下卷、叶片黄化、叶脉外突、植株矮化，严重时致番茄绝收。据报道，导致我国番茄黄化曲叶病的病原有15种，其中在我国发生面积最广、�：ψ钪氐氖欠鸦苹恫《�。番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属(ifegoffiori/YAs)病毒, 该属病毒在自然条件下只能由烟粉風tabaci)以持久性方式传播。
自2006年上�：驼憬群笤诜焉戏⑾址鸦苹恫《疽岳矗貌《疽鸬姆亚恫≡诨厍杆俾涌矗诒本�、山东、江苏、安徽、浙江、海南、福建、云南、广东、广西、新疆等多个省份的番茄上流行爆发。由于全球气候变暖和农业发展格局的变化， 特别是苗木调运等商业活动的日益频繁，使得番茄黄化曲叶病害在我国自南向北迅速扩散和蔓延开来，对番茄生产构成巨大威胁。据不完全统计，我国番茄黄化曲叶病毒病害的年发生面积超过100万亩，年经济损失至少20亿人民币。目前该病害已经成为我国番茄生产上一个重要的制约因素。
由于番茄黄化曲叶病毒病害在我国的发生处于上升时期、暴发态势严峻，因此强化番茄黄化曲叶病毒的早期监测和预警技术非常紧迫。但是由于番茄黄化曲叶病毒只存在于植物韧皮部，且感病植物中病毒的含量较低，致使常规的病毒病检测办法难以应用。目前，番茄黄化曲叶病毒的检测技术主要依赖PCR扩增、核酸杂交和血清学等手段。PCR检测技术虽然灵敏性高，但需要经过基因组DNA提取——PCR扩增——电泳分析、甚至基因组序列测定这些步骤，实验操作过程繁琐、耗时长、且该技术完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂而致试验成本较高，不利于田间病毒病的大规模检测。另外PCR技术因假阳性高等原因也不易向非专业人员推广。核酸杂交技术虽特异性强，但实验操作更为专业和繁琐，除高度依赖仪器外对试剂也有很高要求。传统使用的放射性同位素虽然灵敏性高，但该试剂对人体和环境均具有一定的危害，不利于环保。最近推出的替代性产品如地高辛试剂等虽无放射性污染但价格昂贵，从经济性和实用性的角度使得核酸杂交技术难以应用于田间大量病毒样品的检测。以单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术是较为简便的检测方法，它具有操作方便、灵敏度高等优点，但传统血清学方法如三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)、抗原包被ELISA (ACP-ELISA)等方法需要在48孔或96孔酶联反应板进行，实验步骤多，各步骤反应时间长，数据借助酶标仪器读值，且对仪器依赖性高，实验材料成本高等特点不利于大规模样品的检测。本课题组原先申请的专利“分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用”(中国专利申请号为201210004197. 7)中，其实施例已简要提及dot-ELISA和 Tissue-blot ELISA检测方法，但利用该方法在实际使用时发现，该方法只适合在一种植物(即番茄叶片)中检测病毒，不适合其他植物；另外，由于植物取样部位和试剂配比的问题致使病毒检出率有待提高。特别是实施例中提及的Tissue-blot ELISA试剂盒，在田间应用时番茄叶片消耗多、试剂用量大、成本较高。发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，在进一步优化各实验数据的基础上，提供检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹ELISA方法及其试剂盒及应用。
检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA快速鉴定方法，包括如下步骤1)硝酸纤维素(NC)膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1X1 Cm，在NC膜的一角做标记，平整放入培养皿中央；2)植物样品处理按重量体积比I:30至I: 50 (克/毫升)比例称取植物茎干，加入O.01 mo I/L PBS将植物组织研磨成匀浆状；3)点样用移液枪吸取2ul植物上清液点到划好的格子中央；4)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mo I/L PBS)的比例配制得至Ij 5%的脱脂奶粉封闭，37 °C静置0.5-1小时；5)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；6)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱3次，每次3分钟；7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1: 8000倍稀释，37°C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的NC膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应待NC膜上的样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的组织印迹ELISA快速检测方法，包括如下步骤1)NC膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1X1 cm，在NC膜的一角做标记，平整放入培养皿中央；2)植物样品处理和点样用刀片切割植物叶柄，使切口平齐，将切口截面按置于划好的格子中央3飞秒，每个植物样品重复上述操作步骤一次；操作过程中，每切割一个植物样品更换一次刀片或用酒精棉消毒刀片；3)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mo I/L PBS)的比例配制得至Ij 5%的脱脂奶粉封闭，37 °C静置0.5-1小时；4)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；5)洗涤弃液体，NC膜用PBST摇动洗脱3次，每次3分钟；CN 102928598 A书明说3/8页7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1:8000倍稀释，37 °C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应待NC膜上的样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒，包括如下步骤1)试剂盒主要试剂与材料20X 浓缩 PBS (O. 2 mol/L PBS)10 ml单克隆抗体O. I mlAP标记羊抗鼠IgG 二抗O. 02 mlIOX浓缩封闭液10 mlIOX浓缩抗体稀释液20 ml20 X浓缩洗涤液70 ml封闭剂15 g底物缓冲液70 mlNC膜7张NBT储备液O. 4 mlBCIP储备液O. 2 ml2)试剂盒操作步骤组织印迹ELISA步骤2.I)取番茄茎干或叶柄，用刀片横切，将横切面立即在膜上压印3-5秒。转步骤2. 4。
dot-ELISA 步骤2. I)番茄茎干称重后，按重量体积比I: 30-1: 50 (克/毫升)加入O. 01 mol/L PBS 研磨；2. 2) 5000 rpm 离心 3 分钟；2. 3)取2 ul上清点到NC膜上；2. 4)室温干燥10分钟；2. 5) NC膜浸入到含5%封闭剂的I X封闭液中室温封闭30-60分钟；2.6) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60分钟； 2.7) IX洗涤液洗膜3-4次，每次3分钟；2.8) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30-60分钟；2.9) IX洗涤液洗膜5-6次，每次3分钟；2. 10)显色底物 NBT 66 ul 和 BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到 10 ml 底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应(显色5-20分钟)，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察并记录结果。
3)试剂盒使用注意事项73. 1)NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸NC膜；3. 2) NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；3. 3)抗体在使用前10分钟内稀释；3. 4)底物显色液要现配现用；3. 5) NC膜CK+处为阳性对照；NC膜CK-处为阴性对照；3.6)试剂盒反应温度为4-38°C，最佳反应温度为37°C ；3.7)试剂盒能检测200个田间样品。
4)贮藏条件及保存期试剂盒于2-8°C避光保存，但抗体-20°C冷冻保存更佳，NBT储备液和BCIP储备液须-20°C冷冻保存。保存期该产品有效期为6个月。
所述的方法适用于番爺黄化曲叶病毒的寄主-爺科植物，所述的爺科植物包括番茄、辣椒、茄子、烟草、龙葵、曼陀罗，取样部位为植物的茎干或叶柄。
所述的方法可对田间大量样品的带毒情况进行调查，计算番茄黄化曲叶病毒在田间的侵染率，评估番茄黄化曲叶病的田间发生分布及流行爆发趋势以便及时采取防治措施。
本发明有益效果O本发明提供了两种快速检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的血清学方法—— dot-ELISA和组织印迹ELISA鉴定方法。
2)本发明提供的检测方法适用性广。番茄黄化曲叶病毒大多感染茄科植物，而本发明提供的检测方法能有效应用于番茄、辣椒、茄子、烟草、龙葵、曼陀罗等多种茄科植物， 扩大了植物的检测范围。
3)针对番爺黄化曲叶病毒只存在于植物韧皮部,且植株中病毒含量低的特点，经过多次严格对比验证，本发明提出取样部位为番茄黄化曲叶病毒积累量高的植物茎干或叶柄。植株取样部位的改变提高了检测的灵敏性。
4)本发明提供的检测试剂盒中的各种试剂的浓度和参数配比是经上百次独立实验精细调试优化所得。比如降低了植物组织的取样量，减小对植物的损伤以保护农民的最大经济效益；提高了单克隆抗体的使用浓度，优化了试剂的参数配比等，在节约成本的基础上实现病毒检出率最高。各项指标综合运用能达到检测灵敏度高，特异性强，耗时短，成本低，而且具有整个操作简单快速，对专业技能要求低，实验过程不需要仪器，实验材料易于携带，经济环保，实用性强等优势。一个人只需3-4小时可完成几百份植物样品的检测，利于田间大规模的推广和应用。
图1-3 dot-ELISA 磨样示意图；图4 dot-ELISA方法检测田间番茄样品的结果；图5-6组织印迹ELISA操作示意图；图7组织印迹ELISA方法检测田间番茄样品的结果；图8田间番茄样品经PCR验证结果；图9番茄黄化曲叶病毒(TYLCV) dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒外包装；图10番茄黄化曲叶病毒(TYLCV) dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒的材料与试剂；图11利用试剂盒中的dot-ELISA方法检测杭州番茄样品的结果；图12利用试剂盒中的组织印迹ELISA方法检测杭州番茄样品的结果。
具体实施方式
实施例一利用dot-ELISA的方法检测田间番爺植株中番爺黄化曲叶病毒的侵染情况。
从河南郑州农田采集具有发病症状的番茄14株，按照dot-ELISA的操作方法进行检测1)NC膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每孔规格I X I cm，在NC膜的右下角做标记，平整放入培养皿中央；2)样品处理按I:50 (重量体积，克/晕升)的比例称取番爺叶柄，加入O. 01 mol/ L PBS将番茄组织研磨成匀浆状(图1-3)；3)点样离心后用移液枪吸取2ul上清点到划好的格子中央；4)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，加入5%的脱脂奶粉(按5g脱脂奶粉加 100 ml PBST 缓冲液(含 0. 05% Tween-20 的 0. 01 mol/L PBS)的比例配制)封闭，37°C静置30分钟；5)加一抗加入番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，单克隆抗体用5%的脱脂奶粉I: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；6)洗涤弃液体，NC膜用PBST摇动洗脱3次，每次3分钟；7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗(A3562 Sigma)，二抗用5%的脱脂奶粉1: 8000倍稀释，37°C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST摇动洗脱5次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物缓冲液(0. I mol/L Tris C1、0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)中混匀，洗好的 NC 膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应待阳性对照呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
实验结果如图4所示，14株番茄样品的阳性率为100% (C7、D7为阳性对照，C8、D8 为阴性对照)，表明番茄黄化曲叶病毒在该地区较为普遍，发病较为严重。
实施例二 利用组织印迹ELISA的方法检测田间番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的侵染情况。
从河南郑州农田采集具有发病症状的番茄14株，按照组织印迹ELISA的操作方法再次进行检测1)NC准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每孔规格IXI cm, 在NC膜的右下角做标记，平整放入培养皿中央；2)点样用刀片切割叶柄，使切口平齐(图5)，将切口截面按置于划好的格子中央Γ5 秒(图6)，每个样品重复一次(用同一刀片另切一次，重复上述操作步骤)，操作过程中，刀片每切割一个样品用酒精棉擦拭一次；3)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，加入5%的脱脂奶粉(按5g脱脂奶粉加 100 ml PBST缓冲液的比例配制)封闭，37°C静置30分钟；4)加一抗加入番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，单克隆抗体用5%的脱脂奶粉I: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；5)洗涤弃液体，NC膜用PBST(含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)摇动洗脱3 次，每次3分钟；7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗(A3562 Sigma)，二抗用5%的脱脂奶粉1: 8000倍稀释，37°C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST摇动洗脱5次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物缓冲液中(O. I mol/L Tris C1,0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应待样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
检测结果如图7所示，样品阳性率为100% (D5、D6为阳性对照，D7、D8为阴性对照)，同dot-ELISA检测所得结果一致。另外，利用番茄黄化曲叶病毒的特异性引物PF (5，-GGCGCGCCCATGTCGAAGCGACCAG-3，)和 PR (5，-GTCGACTTAATTTGATATTGAATCATAGAAATAG-3，) 对该批次样品进行PCR验证，14个样品都扩增出约750 bp的目的条带(图8)，PCR实验数据证实这14个田间样品都携带番茄黄化曲叶病毒。这表明两种血清学快速检测方法是准确、灵敏、可靠的，适用于田间大批量样品检测的推广应用。
实施例三番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒的开发I.试验原理dot-ELISA和组织印迹ELISA是以NC膜为固相载体的ELISA检测方法，具有简便、快速、特异、敏感、便于推广、不需特殊仪器等优点，应用前景广。将含番茄黄化曲叶病毒样品的提取液点到或压印到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗番茄黄化曲叶病毒的鼠单抗， 则单抗与固相抗原(番茄黄化曲叶病毒)形成抗原_抗体复合物；再加入碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG抗抗体(即二抗)，则抗抗体与上述抗原-抗体复合物结合形成抗原_抗体_酶标抗抗体复合物；加入显色底物，复合物上的酶催化底物生成沉淀型有色产物而显色。由于每步之间均有洗涤的步骤，若待测样品中不含番茄黄化曲叶病毒则酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。肉眼观察斑点颜色有无及深浅来进行样品中番茄黄化曲叶病毒的定性和半定量检测。
2.主要试剂与材料20X 浓缩 PBS (0. 2 mol/L PBS)10 mlTYLCV单克隆抗体0. I mlAP 标记羊抗鼠 IgG 二抗(A3562 Sigma)0. 02 ml10X 浓缩封闭液(0. I mol/L PBST)10 ml10X浓缩抗体稀释液(50%的脱脂奶粉、0. lmol/L PBST)20 ml20X 浓缩洗涤液(O. 2 mol/L PBST)70 ml封闭剂(脱脂奶粉)底物缓冲液(O. I mol/L Tris C1.0. 025 mol/L MgCl、pH9.5) NC 膜(Amersham)以上试剂均保存于4°C下 NBT 储备液(S377I Promega)BCIP 储备液(S377I Promega)O. 4 ml O. 2 ml以上试剂均保存于-20°C下3.操作步骤组织印迹ELISA步骤I)取番茄茎干或叶柄，用刀片横切，将横切面立即在膜上压印3-5秒，其中叶片需紧卷成筒后用刀片横切。转步骤4)。
dot-ELISA 步骤1)番爺莖干或叶片称重后，按1:30-1:50(重量体积，克/晕升)加入O. 01 mol/L PBS 研磨；2)5000 rpm 离心 3 min;3)取2ul上清点到NC膜上；4)室温干燥10min;5)NC膜浸入到含5%封闭剂的封闭液中室温封闭30-60 min;6)NC膜放入用抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min;7)洗涤液洗膜3-4次，每次3min;8)NC膜放入用抗体稀释液1: 8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育 30-60 min;9)洗涤液洗膜5-6次，每次3min;10)显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应 (显色5-20 min),即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录结果。
4.缓冲液配比1)0.01 mol/L PBS :用去离子水将20X浓缩PBS按I :19体积比进行稀释(S卩I份20X 浓缩PBS+19份去离子水或矿泉水)。
2)含5%封闭剂的封闭液用去离子水将10X浓缩封闭液按I :9体积比进行稀释 (I份10X浓缩封闭液+9份去离子水)，稀释后按每20 ml稀释封闭液加入Ig封闭剂配制成含5%封闭剂的封闭液，配制好的封闭液在4°C冰箱可保存一个月。
3)洗涤液用去离子水将20X浓缩洗涤液按I :19体积比进行稀释(或按需量稀释)(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)，稀释后的洗涤液在4°C环境可保存一个月。
4)抗体稀释液用去离子水将10X抗体稀释液按I :9体积比进行稀释(I份10X 抗体稀释液+9份去离子水)，稀释后按每20 ml稀释液加入Ig封闭剂配制成抗体稀释液。 配制好的抗体稀释液在4°C冰箱可保存一个月。
5)底物显色液66 uL NBT和33 uL BCIP加到10 mL的底物缓冲液混匀。
5.注意事项111)NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子和戴一次性PE手套取膜；2)NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；3)抗体在使用前10min之内稀释；4)底物显色液要现配现用；5)硝酸纤维素膜CK+处为阳性对照；硝酸纤维素膜CK-处为阴性对照；6)试剂盒反应温度为4-38°C，最佳反应温度为37°C；7)试剂盒能检测200个田间样品。
6.贮藏条件及保存期试剂盒于2-8°C避光保存，但抗体-20°C冷冻保存更佳，NBT储备液和BCIP储备液须-20°C冷冻保存。保存期该产品有效期为6个月。
实施例四番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒测试用研发的植株检测试剂盒(图9和图10)，分别通过dot-ELISA及组织印迹ELISA的方法对田间具有发病症状的植物样品进行检测，结果快速、可靠(图11、12)，表明该植株检测试剂盒可大批量使用。
权利要求
1.一种检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA快速鉴定方法，其特征在于包括如下步骤1)硝酸纤维素(NC)膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1X1 cm，在NC膜的一角做标记，平整放入培养皿中央；2)植物样品处理按重量体积比I:30至I: 50 (克/毫升)比例称取植物茎干，加入O.01 mo I/L PBS将植物组织研磨成匀浆状；3)点样用移液枪吸取2ul植物上清液点到划好的格子中央；4)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37°C静置O. 5-1小时，所述的PBST缓冲液含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ；5)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；6)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱3次，每次3分钟；7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1: 8000倍稀释，37°C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的NC膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应待NC膜上的样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
2.一种检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的组织印迹ELISA快速检测方法，其特征在于包括如下步骤1)NC膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格I X Icm，在NC膜的一角做标记，平整放入培养皿中央；2)植物样品处理和点样用刀片切割植物叶柄，使切口平齐，将切口截面按置于划好的格子中央3飞秒，每个植物样品重复上述操作步骤一次；操作过程中，每切割一个植物样品更换一次刀片或用酒精棉消毒刀片；3)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37°C静置O. 5-1小时；所述的PBST缓冲液含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ；4)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1: 2000倍稀释，37°C孵育I小时；5)洗涤弃液体，NC膜用PBST摇动洗脱3次，每次3分钟；7)加酶标二抗弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1:8000倍稀释，37°C孵育I小时；8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟；9)显色显色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟；10)终止反应 待NC膜上的样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果ddH2 O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
3. 一种番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA和组织印迹ELISA检测试剂盒，其特征在于包括如下步骤I)试剂盒试剂与材料20X 浓缩 PBS (O. 2 mol/L)10 ml单克隆抗体O. I mlAP标记羊抗鼠IgG 二抗O. 02 mlIOX浓缩封闭液10 mlIOX浓缩抗体稀释液20 ml20 X浓缩洗涤液70 ml封闭剂15 g底物缓冲液70 mlNC膜7张NBT储备液0. 4 mlBCIP储备液0. 2 ml2)试剂盒操作步骤 组织印迹ELISA步骤 2. I)取番茄茎干或叶柄，用刀片横切，将横切面立即在膜上压印3-5秒；P'dot-ELISA 步骤 2. I)番爺莖干称重后，按重量体积比1: 30-1:50 (克/毫升)加入0.01转步骤2. 4研磨；2. 2) 5000 rpm 离心 3 分钟；2. 3)取2 ul上清点到NC膜上；2. 4)室温干燥10分钟；2. 5) NC膜浸入到含5%封闭剂的I X封闭液中室温封闭30-60分钟；2. 6) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60分钟；2.7) IX洗涤液洗膜3-4次，每次3分钟；2.8) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30-60分钟；2.9) IX洗涤液洗膜5-6次，每次3分钟；2.10)显色底物NBT 66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，显色时间5-20分钟，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察并记录结果；3)试剂盒使用注意事项3.1)NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸NC膜；3.2) NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；3.3)抗体在使用前10分钟内稀释；3.4)底物显色液要现配现用；3.5) NC膜CK+处为阳性对照；NC膜CK-处为阴性对照；.3.6)试剂盒最佳反应温度为37°C ；.3.7)试剂盒能检测200个田间样品；4)贮藏条件及保存期试剂盒于2-8°C避光保存，但其中抗体_20°C冷冻或2-8°C保存，NBT储备液和BCIP储备液须_20°C冷冻保存；保存期该试剂盒有效期为6个月。
4.一种如权利要求1、2、3任一项所述的方法或试剂盒的应用，其特征在于所述的方法适用于番茄黄化曲叶病毒的寄主——茄科植物，所述的茄科植物包括番茄、辣椒、茄子、烟草、龙葵、曼陀罗，取样部位为植物的茎干或叶柄。
5.一种如权利要求1、2、3任一项所述的方法或试剂盒的应用，其特征在于所述的方法可对田间大量样品的带毒情况进行调查，计算番茄黄化曲叶病毒在田间的侵染率，评估番茄黄化曲叶病的田间发生分布及流行爆发趋势以便及时采取防治措施。
全文摘要
本发明公开了检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹ELISA方法及其试剂盒及应用。利用针对番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白制备的单克隆抗体，建立配比最优化的斑点酶联免疫吸附法(dotenzyme-linkedimmunosorbentassay，dot-ELISA)及组织印记ELISA的方法，并研发快速检测试剂盒。该发明适用于番茄、辣椒、茄子、烟草、龙葵、曼陀罗等茄科植物。利用该发明可对田间蔬菜样品番茄黄化曲叶病毒感染情况进行调查，检测病毒病的发病率，评估番茄黄化曲叶病毒在田间的发生分布情况及流行爆发趋势。该检测方法灵敏度高、特异性好、耗时短、成本低，为番茄黄化曲叶病毒的快速、大规模检测提供技术支撑。
文档编号G01N33/577GK102928598SQ20121042622
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者谢艳, 周雪平, 吴建祥, 矫晓阳, 倪跃群 申请人:浙江大学
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