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专利名称：一种dna生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器的制备技术领域，具体涉及一种石墨烯薄膜DNA生物传感器及制备方法。
背景技术：
近年来，国内外有关DNA传感器的研究十分活跃，正成为生物传感器技术的研究热点，DNA传感器以其简易、快捷、价廉的独特优越性，在分子生物学、医学检验和环境监测等领域具有广泛的应用前景。DNA生物传感器依据DNA分子之间或DNA分子与其它物质的 相互作用(杂化作用)所引起的各种变化来记录、分析发生在传感器和探测目标之间的杂化反应，以完成对目标物的探测和监控。其是以核酸作为分子识别元件，将目标物的存在转变为可检测的电、光、声等信号。石墨烯是一种有一层或几层原子厚度的纯碳原子结构，其C-C键以Sp2结合，形成一个密集的蜂窝状晶格结构；目前，以石墨烯为基础的材料已经引起了科学界的广泛兴趣。Alwarappan等(Subbiah Alwarappan, etal, ASAP, 2009)发现石墨烯基生物传感器的灵敏度和稳定性比单壁碳纳米管高，预示着石墨烯作为新一代的生物传感材料具有很大的潜力。

发明内容
本发明的目的是提供一种DNA生物传感器的制备方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了 DNA生物传感器的制备方法，包括以下步骤I)生物传感器的硅片基底自组装上石墨烯薄膜首先将硅片置于2_5ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡12_14h ；其次，取出硅片用去离子水冲洗，并用氮气吹干；完成硅片与十八烷基三甲氧基硅烷的自组装；把自组装后的硅片放入石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装；2)生物传感器的金膜基底自组装上石墨烯薄膜首先将金膜置于2_5ml的标准I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3_5h ;其次，取出金膜用去离子水冲洗，并用氮气吹干，完成金膜与标准I-十八硫醇的自组装；把自组装后的金膜放入石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装；3) DNA的固定及杂交将自组装过石墨烯的硅片和金膜放入2_5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡
5-7h ;取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成十八烷基胺与石墨烯之间的自组装；将自组装过十八烷基胺的硅片和金膜依次在Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分别浸泡24h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成DNA的固定与杂交。所述的十八烷基三甲氧基硅烷溶液为乙醇配制的浓度为0. 01mg/ml。
所述的I-十八硫醇溶液的浓度为0. 28mg/mloDNA生物传感器的制备过程中所述的石墨烯悬浮液和步骤3)中所述的十八烷基胺溶液的浓度均为0. lmg/mlDNA生物传感器的制备过程中所述的步骤3)中所述的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液的浓度均为I U mol/L。本发明设计并组装了具有功能性的石墨烯薄膜，并制作了 DNA生物传感器，通过电化学交流阻抗(EIS)和循环伏安(CV)电性能测试，自组装前后及DNA固定杂交前后电性能有明显的变化(如图Ia和图lb)，通过X射线光电子能谱(XPS)分析，在自组装过程及DNA的固定与杂交过程，元素组成与结构都有明显的变化(如图2);随后，又研究了随着目标DNA浓度的变化，其杂交前后电化学性能的变化，通过差分脉冲伏安法(DPV)电性能测试，明显观察到目标DNA浓度的变化对其峰值的影响(如图3和图4)。
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本发明这种新型DNA生物传感器在DNA生物传感器及DNA检测上有很大的应用前
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图I为石墨烯的拉曼光谱图；由图可知，拉曼峰在l348cm 1 (D 峰)，1583cm 1 (G 峰)，2671cm 1 (2D 峰),sgMcnrHD+G峰)都有明显的吸收，可以确定合成了石墨烯；图2为石墨烯的(a) SEM图和(b) TEM图；图2(a)为石墨烯的SEM图，由图可知，石墨烯卷曲如同弄皱的纸张一样，表面光滑，成二维碳纳米结构，石墨烯在边缘处有褶皱，存在一定的缺陷，不是理想状态中的平整形貌。图2 (b)是石墨稀的TEM图，由图可知,整体上石墨稀形貌是卷曲的片状，出现裙皱起伏的片层结构，这与石墨烯的SEM图以及Raman光谱图的分析吻合；图3为DNA在组装有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后各种元素的XPS图谱；DNA在组装有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后元素C Is,N Is和P 2p的XPS图谱，DNA在组装有十八烷基胺的石墨烯薄膜上固定前后各种元素的XPS图谱。从图3(a)和(b)中可以看出，十八烷基胺中单层膜具有强烈的C Is和N Is信号，而DNA固定后，除掉十八烷基胺和DNA中的C Is和N Is信号外，还出现了明显的P 2p信号，这说明DNA分子固定到在十八烷基胺表面。在缓冲溶液中，由于Pl链上的负电荷与共聚物分子链上的正电荷之间存在静电吸引力，使Pl能够固定在导电聚合物膜上；图4为各种分子在硅片上的自组装过程以及DNA在自组装薄膜上固定和杂交过程中的电化学交流图。
具体实施例方式下面结合的实施例以作进一步的说明。实施例I一种DNA生物传感器的制备方法，其具体的技术方案如下I)生物传感器的硅片基底自组装上石墨烯薄膜首先，将硅片置于2ml用乙醇配制0.01mg/ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡12h ;取出硅片用去离子水冲洗，并用氮气吹干；完成硅片与十八烷基三甲氧基硅烷的自组装；把自组装后的硅片放入浓度为0. lmg/ml的石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡2h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装。2)生物传感器的金膜基底自组装上石墨烯薄膜首先，将金膜置于2ml的浓度为0. 28mg/ml的标准1_十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3h ;取出金膜用去离子水冲洗，并用氮气吹干，完成金膜与标准I-十八硫醇的自组装；把自组装后的金膜放入浓度为0. lmg/ml的石墨烯 悬浮液中，避光密封浸泡2h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装。 3) DNA探针的固定及靶向DNA与DNA探针的杂交将自组装过石墨烯的硅片和金膜放入2ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡5h ；取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成十八烷基胺与石墨烯之间的自组装；将自组装过十八烷基胺的硅片和金膜依次在浓度均为I U mol/L的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分别浸泡24h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成DNA的固定与杂交。实施例2一种DNA生物传感器的制备方法，其具体的技术方案如下I)生物传感器的硅片基底自组装上石墨烯薄膜首先，将硅片置于5ml用乙醇配制0.01mg/ml的十八烷基三甲氧基硅烷溶液中，避光密封浸泡14h ;取出硅片用去离子水冲洗，并用氮气吹干；完成硅片与十八烷基三甲氧基硅烷的自组装；把自组装后的硅片放入浓度为0. lmg/ml的石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡4h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装。2)生物传感器的金膜基底自组装上石墨烯薄膜首先，将金膜置于5ml的浓度为0. 28mg/ml的标准I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡4h ;取出金膜用去离子水冲洗，并用氮气吹干，完成金膜与标准I-十八硫醇的自组装；把自组装后的金膜放入浓度为0. lmg/ml的石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡3h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装。3 ) DNA探针的固定及靶向DNA与DNA探针的杂交将自组装过石墨烯的硅片和金膜放入5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡6h ；取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成十八烷基胺与石墨烯之间的自组装；将自组装过十八烷基胺的硅片和金膜依次在浓度均为I U mol/L的Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液中分别浸泡24h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成DNA的固定与杂交。图 4(a)中的 i)Si、ii)Si+Ttos、iii) Si+Ttos+G 和 iv) Si+Ttos+G+C18NH2 和(b)中的 i)Si+Ttos+G+C18NH2、ii) Si+Ttos+G+C18NH2+Probe DNA, iii) Si+Ttos+G+C18NH2+ProbeDNA+TMM 和 iv) Si+Ttos+G+C18NH2+Probe DNA+TMM+MM0.为整个组装和 DNA 在组装薄膜上的固定和杂交的电化学交流阻抗图。从图4(a)中可以看出，石墨烯具有优异的电性能，随着石墨烯的进一步组装，其表面电荷转移电阻(Rct)和硅片比起来有所降低，其大小降至55. 7KQ，说明石墨烯的组装又增强了电荷的转移率。然后是自组装十八烷基胺，十八烷基胺作为有机小分子，其自组装降低了电荷转移率。自组装十八烷基胺后，其Rct增加至195KQ。由图I交流阻抗曲线的变化及电荷转移电阻Rct的变化，说明石墨烯与十八烷基胺之间完成了自组装。图4(b)显示，十八烷基胺固定DNA后，其电荷转移电阻有所增加。这是因为在十八烷基胺上进行固定的DNA链上产生了一定量的负电荷，负电荷界面与负电荷化的DNA产生静电排斥作用，因此阻碍了电荷的转移，致使Rct增力口。当TMM目标DNA与探针接触时，由于碱基对之间不匹配，无法杂交，并未引起Rct的较大变化。而当MMO目标DNA与探针DNA接触时，由于碱基对之间相互匹配，能够完成杂交，导致了 Rct值的明显变化，从176KQ增加至245KQ。·
权利要求
1.ー种DNA生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)生物传感器的硅片基底自组装上石墨烯薄膜 首先将硅片置于2-5ml的十八烷基三甲氧基硅烷(Ttos)溶液中，避光密封浸泡12-14h ;其次，取出硅片用去离子水冲洗，并用氮气吹干；完成硅片与十八烷基三甲氧基硅烷的自组装；把自组装后的硅片放入石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装； 2)生物传感器的金膜基底自组装上石墨烯薄膜 首先将金膜置于2-5ml的标准I-十八硫醇溶液中，避光密封浸泡3-5h ;其次，取出金膜用去离子水冲洗，并用氮气吹干，完成金膜与标准I-十八硫醇的自组装；把自组装后的金膜放入石墨烯悬浮液中，避光密封浸泡2-4h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成石墨烯的自组装； 3)DNA探针的固定及靶向DNA与DNA探针的杂交 将自组装过石墨烯的硅片和金膜放入2-5ml十八烷基胺溶液中，避光密封浸泡5-7h ；取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成十八烷基胺与石墨烯之间的自组装；将自组装过十八烷基胺的硅片和金膜依次在Pl溶液、TMM和MMO溶液中分别浸泡24h，取出后用去离子水冲洗，再用氮气吹干，完成DNA的固定与杂交。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述的步骤I)中十八烷基三甲氧基硅烷溶液为こ醇配制的浓度为0. 01mg/ml。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在干所述的步骤2)中I-十八硫醇溶液的浓度为0. 28mg/ml。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述的石墨烯悬浮液和步骤3)中所述的十八烷基胺溶液的浓度均为0. lmg/ml。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中Pl溶液、TMM溶液和MMO溶液的浓度均为IrtllO].し
全文摘要
本发明涉及一种DNA生物传感器制备方法，所述DNA生物传感器中硅片基底和金膜基底由石墨烯自组装薄膜组成，其中硅片基底为通过十八烷基三甲氧基硅烷自组装上石墨烯薄膜，而金膜基底为通过1-十八硫醇自组装上石墨烯薄膜。发明设计并组装了具有功能性的石墨烯薄膜，并制作了DNA生物传感器，通过各种电学测试表明，自组装前后及DNA固定杂交前后电性能、元素组成及结构有明显的变化，并能明显观察到目标DNA浓度的变化对其峰值的影响。这种自组装制备的生物芯片在DNA生物传感器及DNA检测上有很大的应用前景。
文档编号G01N27/26GK102788824SQ20121018571
公开日2012年11月21日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者张治红 申请人:张治红