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专利名称：无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测 定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡， 血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆 中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积 为35"~"40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时， 可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶 解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生 素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐 阴离子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合 法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定 性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是 比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离 子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定 的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二 醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做 标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性 范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还 原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的 方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。
本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+辅酶八+氧丙酮酸氧化酶过氧化氢+ 二氧化碳+
乙酰辅酶A
过氧化氢+辅酶 NAD(P)H氧化酶 还原型辅酶+氧 这种方法应用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)酶(偶)联丙酮 酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、 NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase; EC 1.6.3.1)酶促反应比色终点法。丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产 生丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶的作用，最终将 辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试
剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 8 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L
辅酶A 6 mmol/L
本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化 酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。
试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、腺苷二磷酸、草酰
乙酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。
辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、腺苷二磷酸、草酰 乙酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其 辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L腺苷二磷酸 草酰乙酸 辅酶A
8 mmol/L 12 mmol/L 6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1， 测试主波长340ran，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体 积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检 测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大
实施例二
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括: 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
腺苷二磷酸 8 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L 辅酶A 6 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L丙酮酸羧化酶 丙酮酸氧化酶
NAD(P)H氧化酶
10000U/L 12000U/L 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1 ，
测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂l、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0
分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大
小,
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 辅酶
腺苷二磷酸 草酰乙酸 辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L
12 mmol/L 6 mmol/LNAD(P)H氧化酶
12000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100 mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
丙酮酸羧化酶
10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定无机磷(磷酸根)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反 应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反 应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0014;吸光度时间 反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R^0.99)线形范围可达18 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4%;试剂测试的精密度(重 复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达O.OOl ± 0.0005 AA/mmol /L;试剂在2—8"C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好， 线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的无机磷(磷酸根)的浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+辅酶A+氧 丙酮酸氧化酶 过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A过氧化氢+辅酶 NAD(P)H氧化酶 还原型辅酶+氧将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小测定结果。
2. 种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L丙酮酸羧化酶1000-——80000 U/L丙酮酸氧化酶1000-——80000 U/LNAD(P)H氧化酶IOOO-——80000 U/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L辅酶A1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围 外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成。辅酶、丙酮酸羧化酶、 丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸 羧化酶组成。辅酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶、腺苷 二磷酸、草酰乙酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620135SQ200810122969
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司