专利名称：痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法
技术领域：
本发明属生化分析领域，是一种痕量样品富集和鉴定的方法。利用一系列具有不同表面性质(不同晶体结构和硅铝比)的沸石纳米粒子，对多肽和蛋白样品进行富集，并对所富集的样品直接进行基质辅助激光解吸离子化质谱的分析和鉴定。
背景技术：
低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，因此，实现低丰度蛋白的有效浓缩是实现其准确分析和鉴定的首要条件之一。实际上在蛋白质组学研究过程中许多方面都涉及到样品的有效富集，以胶内酶解样品的分析为例，由于酶解肽段提取液的体积太大，在质谱分析前必须浓缩。目前最常用的样品浓缩方法有溶剂蒸发法和色谱浓缩法。溶剂蒸发法主要有真空干燥法和冷冻干燥法，这类方法费时费力，而且干燥过程中容器表面吸附会造成大量肽段损失，影响质谱鉴定的灵敏度。色谱浓缩法则是利用亲水/疏水相互作用等吸附肽段，再用少量有机溶剂洗脱，其操作过程繁琐，疏水性强的样品难以被洗脱，而亲水性肽段由于与反相填料作用力弱而回收率差。
发明内容
本发明的目的是获得一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量多肽或蛋白进行质谱分析的新方法。
本发明的工艺方法如下1选择不同类型以及硅铝比的沸石纳米粒子作为样品吸附剂。
2利用选定的沸石纳米粒子进行痕量蛋白质或多肽的富集。
3无需洗脱，直接进行MALDI-TOF/MS分析。
具体条件如下
1一定量的沸石纳米粒子与蛋白质或肽的极稀溶液混合在20-45℃下温浴60-180分钟以促使样品充分吸附。
2离心后弃除上清液，收集下层沸石相，再用适量水稀释。
3适量富集样品后的沸石纳米粒子与有机基质例如2-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)混合后，进行基质辅助激光解吸离子化/质谱测定。
本发明的沸石纳米粒子的粒径是10-200nm范围较为合适。该类沸石粒子不仅具有大晶粒沸石的性能，还有较大的活性外表面、丰富可调的表面性质、外表面独特的离子交换性能和均匀分布的孔口吸附等特点。
本发明利用沸石纳米粒子的表面性质，通过范德华力、氢键、静电吸附、亲水/疏水作用等分子间作用力与生物分子作用达到富集的目的，通过多种作用力的协同效果，克服了单一吸附模式引起的样品吸附歧视效应，具有良好的普适性，通过调解或修饰沸石粒子的某种作用力，这具有更好的针对性。本发明的沸石纳米粒子的表面性质不同对多肽或蛋白的吸附和富集能力不同，因此可根据待富集样品的性质有目的的选择同一沸石纳米粒子或多种沸石纳米粒子混合富集，多种纳米粒子混合可以通过调解或修饰加强其中一种作用力，使其具用一定的特异性，例如可以通过增加沸石晶体铝的含量，提高沸石表面的负电荷密度，进而提高对等电点高的样品的作用能力。
本发明用硅铝比为60的β(β-60)或silicalite-1沸石纳米粒子作为吸附剂为最好。本发明富集时间在60-180分钟，富集温度在25-45℃，样品浓度是2×10-14-2×10-10g/μL，沸石纳米粒子的加入量是10-1000μg/1mL样品。本发明可用任何一种沸石纳米粒子形成浓度可调的稳定的胶体溶液，与蛋白和多肽溶液形成均匀稳定的富集溶液对含量低体积大的生物体系具有更好的适调性，有利于富集的进行。
本发明用沸石纳米粒子与有机基质均匀混合生成细致的结晶，沸石与基质的混晶体的形成有利于基质将所吸收的激光能量转移给被沸石吸附的样品，实现样品的基质辅助激光解析离子化过程；同时均匀细致的结晶体保证了样品分析的重现性和结果的可靠性。
本发明可用任何一种沸石纳米粒子其对多肽或蛋白都有富集作用，都可以与基质均匀混合形成均匀细致的结晶，对基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱测定影响小。本方法操作简单、效率高、效果好。
图1为沸石纳米粒子β-60的扫描电镜图。
图2为沸石纳米粒子silicalite-1的扫描电镜图。
图3与0.25μL 50pg/μL标肽混合物与等体积的α-CHCA饱和溶液在MALDI靶板上的混合结晶图。
图4为等体积(0.25μL)50pg/μL标肽混合物、10mg/mLβ-60沸石纳米粒子与α-CHCA饱和溶液混合物在MALDI靶板上的混合结晶图。
图5为等体积(0.25μL)50pg/μL标肽混合物、10mg/mLβ-60沸石纳米粒子与α-CHCA饱和溶液混合物在MALDI靶板上的结晶图。对比图3和图4、5可以看出沸石纳米粒子可以与有机基质生成均匀、细致的结晶。
图6为50pg/μL标肽混合物的MALDI-TOF/MS谱图。
图7为50pg/μL标肽混合物与等体积10mg/mL的silicalite-1沸石纳米粒子混合点样条件下的MALDI-TOF/MS谱图。对比图6与图7可以看出，纳米沸石粒子的加入不影响样品的MALDI-TOF/MS测定图8为沸石纳米粒子β-60富集标准多肽样品的MALDI-TOF/MS谱图。样品浓度，40fg/μL，实验方法依照实例8。
图9为沸石纳米粒子β-60富集标准多肽样品的MALDI-TOF/MS谱图。样品浓度，40fg/μL，实验方法依照实例9。从图8、9结果可以看出沸石纳米粒子对肽1的浓缩效率可超过1250倍。
图10为沸石纳米粒子富集马心肌红蛋白酶解样品的MALDI-TOF/MS谱图。样品浓度，50pg/μL，实验方法依照实例22。
图11为沸石纳米粒子富集马心肌红蛋白酶解样品的MALDI-TOF/MS谱图。样品浓度，50pg/μL，实验方法依照实例22。
具体实施例方式
下面的实例是对本发明所提供沸石纳米粒子材料进行样品富集和基质辅助激光解吸离子化/质谱直接分析过程的进一步说明。
实例1-5沸石纳米粒子对标肽混合物的基质辅助激光解吸离子化—飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)测定的影响取50pg/μL三种标肽混合溶液0.25μL五份分别点至MALDI靶板上，再依次加入0.25μLH2O、LTL、β-30、β-60和silicalite-1的悬浮液(20mg/mL)，最后依次覆盖等体积的α-CHCA的饱和溶液(0.1％TFA，50％乙腈水溶液)，待结晶干燥后，进行质谱分析。所用质谱MALDI-TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV；正离子模式，反射式TOF检测。
实例6-9多肽样品的富集和质谱测定取1ml多肽样品水溶液分别加入5μL的20mg/mL沸石纳米粒子LTL，β-30，β-60和silicalite-1的悬浊液悬浮液，在37℃下振荡90min；13000g下离心10min，弃除上清，在沸石沉淀中加入5μL H2O，振荡使之悬浮。悬浮液0.25μL与等体积α-CHCA的饱和溶液混合点至MALDI靶板上，依实例1-5条件进行质谱测定。
实例10-14调整20mg/mL的沸石纳米粒子的加入量为1，2，10，20，50μL，其他条件不变，重复上述浓缩和质谱实验。
实例15-17调整吸附时间为30，60，120min，其他条件同实例6-9，进行浓缩—质谱实验。
实例18-19调整吸附温度为20，45℃，其他条件同实例6-9，进行浓缩—质谱实验。
实例20-23蛋白质酶解物的鉴定蛋白质依照文献的方法酶解，取5mg/ml马心肌红蛋白(myoglobin)的NH4HCO3溶液(20mmol/L)，沸水中加热5分钟，以促使蛋白质变性，室温冷却。以底物/酶质量比50∶1的比例加入胰蛋白酶的溶液，37℃下恒温反应12小时以上。将产物稀释至50pg/μL，取0.5mL样品分别加入5μL的20mg/mL的LTL，β-30，β-60和silicalite-1的悬浊液，依照实例6-9的方法进行样品富集，依实例20的方法进行质谱分析。质谱结果通过proteinprospectors进行数据库检索(http//prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm)。
下表是实例中使用的三种标准多肽的性质
下标是实例20-23的马心肌红蛋白样品数据库检索结果
权利要求
1.一种痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法，其特征是利用沸石纳米粒子分子对多肽和蛋白样品的吸附，对痕量多肽或蛋白进行富集后，无需洗脱步骤直接完成基质辅助激光解吸离子化/质谱的分析检测，具体过程是(1)以沸石纳米粒子作为纳米吸附剂，加入多肽或蛋白质样品的水溶液富集，样品浓度是2×10-14-2×10-10μL，富集时间在60-180分钟之间，富集温度在20-37摄氏度之间，沸石纳米粒子量是10-1000μg/1mL样品；(2)被富集的样品无需洗脱，直接与基质均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行基质辅助激光解吸离子化/质谱分析；(3)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
2.按照权利要求1所述的直接分析的方法，其特征是沸石纳米粒子的粒径是10-200nm。
3.按照权利要求1所述的直接分析的方法，其特征是沸石纳米粒子进行富集样品的时间是60-180分钟。
4.按照权利要求1所述的直接分析的方法，其特征是沸石纳米粒子进行富集样品的温度是25-45℃。
5.按照权利要求1所述的痕量多肽和蛋白及其直接分析的方法，其特征是沸石纳米粒子是β-60或silicalite-1。
6.按照权利要求1所述的痕量多肽和蛋白及其直接分析的方法，其特征是沸石纳米粒子是一种或多种的混合。
全文摘要
本发明是一种以沸石纳米粒子作为纳米微吸附剂，进行痕量肽及蛋白样品的富集—基质辅助激光解析离子化质谱直接分析的方法。沸石纳米粒子对蛋白质和多肽有很好的吸附效果，与基质辅助激光解析离子化质谱有很好的相容性，被沸石纳米粒子吸附的样品无需样品洗脱步骤可直接进行基质辅助激光解析离子化质谱分析，操作简单，避免了洗脱过程带来的样品损失。本发明对多肽的富集效率最高可达1250倍以上，50×10
文档编号G01N30/08GK1560625SQ200410016889
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者王晓燕, 张亚红, 樊惠芝, 唐颐, 杨芃原 申请人:复旦大学
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