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专利名称：：一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因序列及其应用。
背景技术：
：微囊藻毒素(microcystins,MC)是水华发生时水体中蓝藻爆发性繁殖产生的次生代谢产物。MCs是一个结构相似的环七肽家族，目前在淡水中已发现80多种不同的MCs(WHO，2004)，其中MC-LR是目前已知的毒性最强的、急性�：ψ畲蟮囊恢值�水蓝藻毒素(Sivonen,1996;韩志国等，2001)。MC-LR是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂，能导致肝坏死、出血或凋亡(Liu等，2000)。近年来水华频繁出现，面积逐年扩散，我国太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都时有发生，严重威胁着生态安全和人类的饮水安全，因此，对水体中微囊藻毒素进行及时准确的监测非常重要。如何建立一种简单、快速、灵敏度高的检测手段，以便采取适当措施减少�：Γ�是目前迫切需要解决的问题。传统检测方法中大多采用HPLC、LC/MS、GC等方法检测水体中微囊藻毒素，这些方法不仅步骤复杂，仪器设备也较昂贵，并不不适合广泛实时的应用。而免疫分析法以其价格低廉，灵敏度高，可操作性强成为一项值得推广应用的检测技术，免疫检测是基于抗原-抗体特异性反应的检测方法，在检测水体中的微囊藻毒素方面，由于其检测速度快，费用低廉而适合大规模样品的快速筛�。黄涓咛匾煨愿吡槊舳榷杂谠ぞ�检测方面有很广阔的应用前景。免疫检测整体上是一种理想的检测方法，其关键在于获得特异性和结合亲和力良好的抗体，特别是单克隆抗体。微囊藻毒素这类小分子有机污染物，属于半抗原物质，其免疫原性很弱或者没有免疫原性，即直接以其免疫动物时，很难大量获得或者根本不产生的抗体，必须要载入到大分子载体物质中，才能成为完全抗原；即使获得符合标准的抗体后，这种抗体的大量生产制备也是一项昂贵费时的工作，一言以蔽之，利用免疫检测方法检测水体中微囊藻毒素，目前为止抗体的大量制备仍然是一个难题。随着基因工程技术的发展起来的重组抗体技术为这个难题的解决带来了福音，重组抗体技术是将单克隆抗体的抗原活性识别区域的基因拼接起来，克隆到常用载体中转化微生物，利用微生物生产单链抗体，这些单链抗体具备原单克隆抗体的抗原结合活性，McElhineyJ.等从人噬菌体体库中筛选出一株抗MC-LR单链抗体，能够检测出低于世界卫生组织所规定饮用水标准的指导值(l吗/L)[9]，因此单链抗体的检测灵敏性得到证实。而重组抗体技术生产单链抗体比传统的单克隆抗体制备方法简单、经济、周期短，因此是免疫检测技术运用中的一项理想的辅助技术，在抗微囊藻毒素的单链抗体制备中有广阔的运用前景。
发明内容本发明针对上述领域中的缺陷提供一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用，为微囊藻毒素抗体制备提供了简便、经济的途径。一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示的序列。上述重链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqIDNo.5所示。一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的轻链可变区基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示的序列。上述轻链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.6所示。一种单链抗体的基因，其特征在于包括上述如SeqIDNo.l所示的重链可变区基因序列和如SeqIDNo.2所示的轻链可变区基因序列。上述单链抗体的基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。上述单链抗体的基因序列编码的多肽。上述多肽的氨基酸序列如SeqIDNo.4所示。包含所述单链抗体的基因序列的表达载体pET-MC。扩增上述重链基因序列的简并引物和特异性引物，简并引物HFR1:5'-SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3,特异性正向引物VH-B:5'-GGGAATTCCATATGGAGGTTAAGCTGCAGGAGTC-3'，特异性正向弓l物Vh-F:5'-CCGCTACCACCCCCTCCAGATCCGCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCGT-3';扩增上述轻链基因序列的简并引物和特异性引物，简并引物LFR:5'-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3，特异性正向引物VL-B:5'-CTGGAGGGGGTGGTAGCGGTGGAGGCGGGAGTGATATTGTGATGACACAGTC隱3',特异性反向引物VL-F:5'-GGTCTCGAGTTACCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3'。上述多肽作为单链抗体在检测及定量微囊藻毒素中的应用。本发明采用根据鼠源单克隆抗体的保守区基因序列设计简并引HFR1/LFR，以一株表达抗MC-LR的单克隆抗体的杂交瘤细胞G5的总RNA为模板，经RT-PCR分别扩增出1500bp和900bp的两个基因片段(图l)。测序后，序列分析表明，扩增的大片段为1473bp，如SeqIDNo.7所示，为单克隆抗体重链的DNA序列，包括部分重链可变区(VH)，完整的CH1、CH2、CH3三个恒定区和3'端非编码区，其中VH大小为363bp，编码121个氨基酸；扩增到较小的片段为880bp如SeqIDNo.8所示，为轻链DNA序列，包括部分轻链可变区(VJ，完整的恒定区和3'非编码区，其中V,.,大小为336bp，编码112个氨基酸。Vh和Vl符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，均含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基，且基因内无终止密码子，表明所克隆的序列为鼠源抗体的基因序歹ll(Martin,A.C.R.AccessingtheKabatAntibodySequenceDatabasebyComputer.PiOrE/AAS:c'/wre，Fw"ctowadGe朋"c、1996,25:130-133);根据扩增得到的片段设计特异性引物VH-B/VH-F，VL-B/VL-F扩增出该单克隆抗体重链可变区Vh的基因其序列如SeqIDNo.l所示及轻链可变区V,」的基因其序列如SeqIDNo.2所示。本发明获得的上述轻链、重链可变区基因序列所编码的多肽具有单克隆抗体抗原结合区域的氨基酸序列，可作为^链抗体或者多价抗体的组成部分，用于免疫检测或者抗原物质的定量。本发明获得的轻链和重链可变区基因序列可重组成一条单链抗体基因，也可以与其他抗体的可变区基闲重组成多价抗体基闲，本发明中采用重叠延伸PCR扩增法将SeqIDNo.l与SeqIDNo.2拼接起來得到单链抗体scFv基因，其中将两条基因序列拼接起来的过渡基因是p丄选的，轻链与重链的前后顺序也没有特别的要求。本发明优选采用Huston等(HustonJS,LeuinsonD,Mudgett-HonterM,etal.Proteinengineeringofanantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsinglechainFvanalogueproducedinEscherichiacoli.尸racAto/.4c"<i5t/，7988,85(16):5879-5883)根据Fab片段X线晶体衍射分析资料设计出的具有刚性结构的15肽(Gly4Ser)3作为轻链与重链的连接肽，将15肽(Gly4Ser)3的基因序列设计到重链特异性引物VH-F的3'端，轻链特异性引物VtB的5'端，通过重叠延伸PCR引入连接肽基因序列，获得如SeqlDNo.3所示序列的单链抗体基因，其核苷酸序列结构为5'-VH-linkcr-VL-3'(图6)。重组获得scFv基因序列可编码包含有单克隆抗体的轻链与重链的抗原结合区域蛋白质的氨基酸序列。本发明将获得重组scFv基因序列SeqIDNo.3构建到载体pET-28a(+)中获得表达载体pET-MC,并转化大肠杆菌OrigamiTM2，获得的重组子命名为pScFv，pScFv表达的蛋白经纯化后在SDS-PAGE电泳胶上显示出一条大小约为30KD的蛋白；经过Westernblot检测，结果分析表明，鼠抗His抗体能与此30KD的表达产物进行特异结合反应，而与其它条带均无结合反应图3B，证明此蛋白即为目的单链抗体蛋白。本发明还通过ELISA方法检测本争链抗体与MC-BSA之间特异识别能力,其中，MC-BSA为偶联在BSA分子上的MC-LR。测定结果表1显示scFv抗体与MC-BSA呈阳性反应，相比，对照呈阴性反应，试验数据表明该蛋白具有与抗原竞争性结合的能力，且结合的强度与所加的单链抗体的浓度呈JT.相关。实验结果说明本发明获得的重组单链抗体基因可以在大肠杆菌中表达，其表达产物可以代替单克隆抗体进行免疫检测反应以检测或监控水体中的微囊藻毒素，解决了难以大量快速获得单克隆抗体的问题。本发明的单链抗体基因序列编码的多肽包含抗微囊藻毒素单克隆抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列，其中连接轻链与重链的过渡肽是可选的，本发明获得的单链抗体基因序列SeqIDNo.3编码的多肽序列如SeqIDNo.4所示，SeqIDNo.4所示的序列符合小鼠免疫球蛋白可变区的特征，含有重链部分的4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基以及轻链部分的4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基(图4)。该氨基酸序列可代替抗微囊藻毒素的单克隆抗休用于免疫检测反应中以检测水体中的微囊藻毒素。本发明获得的单链抗体基因可作为构建多价抗体的组成单元，即可应用于制备多价(具有三个或更多个功能性抗原结合部位的基因工程抗体)高亲和力的抗体。其利用微生物大量表达的单链抗体蛋白可用于水体中微囊藻毒素的批量检测与监控。说明书附图图1重链和轻链基因序列的PCR扩增验证，M:DL2000plusmarker;1:重链基因的PCR扩增；2:轻链基因的PCR扩增。图2Vh和Vl的併接。M:DL2000plusmarker;1:VH和VL的拼接产物图3A抗微囊藻毒素scFv的SDS-PAGE，图3B抗微囊藻毒素scFv的Westernblot结果。M:蛋白Marker;1与5:转化pET-28a的Origammi2菌液2与4:转pET-M的Origami2菌液；3与6:回收的scFv。图4单链抗体基因序列编码的氨基酸序列。图5抗微囊藻毒素scFv蛋白与纯化回收的scFv蛋白，M:蛋白Marker;1:转化pET-MC的Origami2粗菌液；2、3、4、5分别为NTA-0、NTA-20、NTA-40和NTA-60;6:回收的scFv。图6为scFv表达载体的简单示意图。具体实施方式1材料和方法分泌抗微囊藻毒素(MC-LR)抗体的杂交瘤细胞株G5由中闺疾病预防控制中心营养与食品安全所提供。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；表达载体pET-28a(+)和JM109(保存在中国农业科学院农产品加工所本专利的发明人所在实验室，公众可获得)。Origami2购自Novagen公司。RNAisoReagent、ExTaq、T4DNA连接酶和限制性内切酶购自TaKaRa公司；M-MLV反转录酶、dNTPs和RNA酶抑制剂购自Promega公司；微囊藻毒素标准品为美国Beacon公司产品；MC-BSA抗原的合成由北京博奥森生物技术有限公司完成；鼠抗His抗体和羊抗鼠IgG-HRP购自天根公司；BCA法蛋白浓度定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。2引物设计引物名称引物序列Anchor5'-GCGAGCTCCGCGGCCGCG-3';，HFR15'-SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3';LFR5'-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3';线部分为AWeI位点)；(GAGACGGTGACCGT墨3';VL-B5'-CTGGAGGGGGTGGTAGCGGTGGAGCiCGGGAGTGATATTGTGATGACACAGTC-3';VL-F5'-GGTCTCGAGTTACCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3'(划线部_分为屈oI〗立点)_简并引物HFR1与LFR:根据鼠源免疫球蛋白基因的保守区基因序列设计(ZhongdeWang,MurisikuRaifu,MeredithHoward,LaurieSmith,etal.UniversalPCRamplificationofmouseimmunoglobulingenevariableregions:thedesignofdegenerateprimersandanassessmentoftheeffectofDNApolymerase3Xto5Xexonucleaseactivity.JournalofImmunologicalMethods233—2000.167—177)，分别以HFR1、Anchor和LFR、Anchor扩增抗体的重链基因IgH和轻链基邸gL。特异性引物VH-B/V-F、Vl-B/Vl-F，其中Vu-B/Vu-F是根据扩增出的抗体重链基因IgH的测序序列设计的特异性引物对，用于扩增重链可变区基因序列。VrB/VrF是根据扩增出的抗体轻链基因IgL的测序序列设计的特异性引物对，用于扩增轻链可变区基因序列。另外在Vh-F的3'端，V^B的5'端设计了连接肽的基因序歹!)，用于重叠延伸PCR中引入连接肽的基因Huston等(HustonJS，LeuinsonD,Mudgett-HonterM,etal.Proteinengineeringofanantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsinglechainFvanalogueproducedinEscherichiacoli.PracA^/Jcad5W,7988,85(16):5879-5883)根据Fab片段X线晶体衍射分析资料设计出的具有刚性结构的15肽(Gly4Ser)3的基因序列。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例1单克隆抗体重链及轻链基因序列的扩增步骤l杂交瘤细胞总RNA的提取采用RNAisoReagent试剂盒提取细胞总RNA。步骤2反转录合成cDNA第一链以提取的总RNA为模板，用引物IgR进行反转录，反应体系为总RNA3.0pl，5x反转录buffer2.0jil，dNTPs(2.5mMeach)2|il，HPRI(40u/pl)0.5pl，M陽MLV0.5|il，IgR0,5pl，DEPC-H201.5|il。反应条件为室温10min，42t:水浴lh，在冰水中冷却2min后，保存于-20。C。歩骤3抗体重链及轻链基因序列的PCR扩增分别以HFR1、Anchor和LFR、Anchor扩增抗体的重链和轻链基因。反应体系为25pi:10xPCRbuffer2.5(xl，2.5mMdNTPs2|^I，20|iM的上下游引物各1pl，反转录产物1.5|_d，普通Taq0.5pl，ddH20定容至25pl。反应条件为94°C5min;94°C30s，60°C1min，72°C1min;2个循环；94°C30s，59°C1min，72°C1min;2个循环；94°C30s，58°C1min，72°C1min;2个循环；94°C30s，57°Clmin，72°C1min;30个循环；72。C10min。1。/。的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图1，分别在相应的长度处切下目的片段，用胶回收试剂盒回收目的片段，测序后序列分析表明，扩增的大片段1473bp，如SeqlDNo.7所示，为抗体重链的DNA序列，其包括部分重链可变区(VH)，完整的CH1、CH2、CH3三个恒定区和3'端非编码区，其中VH大小为363bp，编码121个氨基酸；扩增到较小的片段为880bp如SeqIDNo.8所示为轻链DNA序列，其包括部分轻链可变区(VL)，完整的恒定区和3'非编码区，其中V^大小为336bp，编码112个氨基酸。Vh和Vl符合小鼠免疫球蛋白可変区基因特征，均含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基，且基因内无终止密码子，表明所克隆的序列为小鼠抗体基因序列抗体重链和轻链基因分别命名为IgH和IgL。步骤4扩增重链可变区基因VH和轻链可变区V^基因特异性引物对VH-B/VH-F与VL-B/VL-F分别扩增出重链可变区基因VH如SeqIDNo.l所示和轻链可变区基因VL如SeqIDNo.2所示。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。实施例2重叠延伸PCR获得单链抗体sefV基因序列采用重叠延伸拼接法将PCR扩增获得的Vh和VL拼接为scFv基因片段。具体过程如下将回收的纯序列Vh和Vt稀释100倍后各加1^到PCR反应管中，体系(2xbuffer12.5pl，2.5mMdNTP2.5|il，VH1VL1pl，pri腦tarTaq0.25pi,ddH20补充到24^1)。PCR反应扩增7个循环(94。C30s，52°C1min，72°C1min)，然后补加VH-B和Vl-F各0.5^，再以同样的反应条件扩增30个循环。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，得到大小约为750bp的片段(图2)，与预期大小相符。将片段回收后与pET-28a(+)载体用AWeI和屈oI分别酶切、连接，然后转化大肠杆菌JM109。经酶切和PCR验证筛选出的阳性重组子命名为pET-MC(图6)，阳性重组子的测序结果表明，scFv基因全长744bp，包括預期的Vh、V^和Linker序列(GGGGS)3，且阅读框架正确。实施例3scFv的表达及WesternBlot分析将经测序验证无误的阳性重组质粒pET-MC和对照质粒pET-28a(+)分别转化大肠杆菌Origami2(DE3)，分别挑取含有重组质�：投哉罩柿５牡ゾ�落于3mlLB液体培养基中37°C培养过夜，然后1:100稀释到新鲜的LB液体培养基中，振荡培养至OD6(k)达0.41.0，分别加入IPTG至终浓度为1mM，0.5mM和0.1mM,然后于37'C诱导目的基因表达。然后以12%的SDS-PAGE电泳分析。结果显示重组质粒的菌株特异性表达出一条大小约为30kD的蛋白(图3A)，而转化空质粒的菌株蛋白粗提液中没有相应的蛋白条带。初步证明该蛋白即为目的蛋白。为了证明该蛋白为所要表达的目的蛋白，用His单克隆抗体和羊抗鼠IgG-HRP进行WesternBlot分析。SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶取下，用清水漂洗后放入转移缓冲液中浸泡，同时剪裁PVDF膜(先用甲醇浸泡1min)和滤纸一同在电转缓冲液中浸泡。在电转夹上依次放置滤纸--凝胶--PVDF膜--滤纸，除净各层间气泡。凝胶侧接负极，纤维膜侧接正极，恒压80V电转23小时。取下PVDF膜，用TBST缓冲液冲洗，加入封闭液室温封闭1小时。加入抗His单克隆抗体室温孵育l小时。TBST洗膜三次，每次510分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多克隆抗体，室温孵育l小时。洗膜同上，加入TMBG,3，5,5'-四甲基联苯胺)底物显色，待显色到理想程度时用清水冲洗，终止反应，凉干纤维膜，照相或放在阴凉避光处保存备用。WesternBlot分析结果显示，鼠抗His抗体仅与此30kD的诱导表达产物反应，而与其他条带均无反应(图3B)，证明此蛋白即为目的蛋白。实施例4scFv的纯化及抗原结合活性测定纯化-从平板上挑取转化重组质粒的单克�。�接种于5mlLB液体培养基中，37。C培养过夜，次曰将过夜培养物按1:100的比例转接到500mlLB液体基中，继续37'C摇床培养2~3小时至OD6oo达0.41.0，力nO.lmM的IPTG,于15。C过夜培养，进行目的蛋白的诱导表达。室温4000rpm离心10min，收集菌体，重悬于1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer将细胞悬�。�加入溶菌酶至1mg/ml，混匀，冰上放置40min，超卢破碎细胞。加入10%TritonX-100，使其终浓度为0.05%,充分混匀，冰上放置15min,冰上超声破碎细胞。15000rpm4'C离心15min，收集上清和沉淀，可溶性表达的目的蛋白即存在于上清中。将NTA树脂装入层析柱，用10倍体积的NTA-OBuffer平衡。将上述样品加到NTA层析柱中，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗柱，以出去非特异结合的蛋白。分别用5倍NTA体积的NTA-20,NTA-40,NTA-60，NTA-80,NTA-100，NTA-200Buffer洗脱，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。目的蛋白洗脱后用0.5M的NaOH溶液洗柱，以除去少量聚集在柱上的目的蛋白和其他非蛋白的杂质。SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。用BCA法测定蛋白浓度。活性测定在96孔酶标板中，每孔加入100nL0.5ng/mL的MC-BSA，经37。C孵育2h，PBST洗涤4-6次，用2。/。的脱脂奶粉封闭lh。上述包被的酶标板经洗板后，分别加入10(VL倍比稀释的纯化蛋白提取液，经37。C孵育2h，洗板后，加入10(HiLl:1500稀释的鼠抗His抗体，再经37"C孵育2h,洗板后，再加入100nLl:2500稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37'C孵育2h，洗板后加底物TMB于37'C显色，用2mol/L的硫酸终止显色，并在450nm波长下测定各孔吸光值。以转化空质粒的菌株粗提液作阴性对照，抗MC-LR单克隆抗体为阳性对照。每个处理三个重复。测定结果(表l)显示scFv抗体与MC-BSA呈阳性反应，而且随scFv抗体浓度的降低，反应在450nm处的吸光值逐渐下降，相比，对照呈阴性反应。试验数据表明该单链抗体可以与微囊藻毒素发生特异性#入-口口o表1scFv的ELISA反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>S卿ENCELISTING<110>中国农业科学院原子能利用研究所<120>—种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用<130>P08566/NC<160〉8<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉363〈212〉DNA<213〉重链可变区基因ra<400〉1tgc兆gagtctggggg鄉ctt兆tg犯gcctgg鄉gtccctg肌actc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagt犯ctatgccatgtctt鹏ttCgCCELgELCt120cc兆8gaag3ggCtgg3gtgggtcgcatccgtgggggcacctactatcca180agggccgattcaccatctcc3gagataatggcaggaacatcctgtacctg240300tacggtagtagctacgtatccttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcc360tea363<210〉2<211〉336<212〉DNA<213〉轻链可变区基因VL<400〉2gdtsttgtgatgacacagtctcctgcttcctt兆ctgtstctctggggcagagggccscc6Gatctc3tgcagggccagc肌朋gtgtcagtgcatctgactgcactggtsc120ceigg6icagccctcatctatcttgcatcc朋cctgg肌tct180ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctggg織gacttcaccctcaacatccat240cctgtgg鄉鄉卿atgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgtgg300acgttcggtggctggaaatc336<210〉3〈211〉744〈212〉DNA<213〉单链抗体scFv基因的核苷酸序列〈400〉3卿gtt卿ctgc鄉agtctggggg娜cttagtgaagcctggagggtccctgaaactc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagtaactatgccatgtcttgggttcgccagsct120ccag卿卿ggctggagtgggtcgcatccattagtagtggtgg鹏cacctactatcca180gacagtgt朋鄉gccgat,tcaccatctccgC3gg肌C3tcctgtacc:tg240gtctg兆gt:cgccatgtttt3CtgtgC犯gaccctattac300tacggt3gtagctacgtatccttcgatgtctggggcgc邻ggaccacggtcaccgtctcc360tc郷aggtggcggatctgga鹏ggtggtagcggtggaggcgggaigtg3tattgtgatg420acacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggc聊gggccaccEitctcatgcagg480gccagc肌肌gt.gtcagtgcactggtaccaacagaaagca540ggacagccscccaaactcctcatctatcttgcatcc肌cctggaatctggggtccctgcc600郷Ucagtggcagtgggtcttcaccctcaacatccatcc660gaagatgctgctgtcagcac兆tagggagcttccgtggacgUcggt卿720ggcaccaagcacgg744<210〉4<211>248<212〉PRT<213〉单链抗体scFv的氨基酸序列<400>4GluValLysLeuGinGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinThrProGluLysArgLeuGluTrpVal:354045AlaSerlieSerSerGlyGlyGlyThrTyrTyrProAspSerValLys505560GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnGlyArgAsnlieLeuTyrLeu65707580GinMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaMetPheTyrCysAla859095ArgProTyrTyrTyrGlySerSerTyrValSerPheAspValTrpGly100105110AiaGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsplieValMetThrGinSerPro130135140AlaSerLeuAlaValSerLeuGlyGinArgAlaThrlieSerCysArg145150155160AlaSerLysSerValSerAlaSerAspTyrSerTyrMetHisTrpTyr165170175GinGinLysAlaGlyGinProProLysLeuLeulieTyrLeuAlaSer180185190AsnLeuGluSerGlyValProAlaArgPheSerGlySerGlySerGly195200205ThrAspPheThrLeuAsn丄丄eHisProValGluGluGluAspAlaAla210215220ThrTyrTyrCysGinHisSerArgGluLeuProT卬ThrPheGlyGly225230235240GlyThrLysLeuGlu245lieLysArg〈210>5<211〉121<212〉PRT<213>VH编码的氨基酸序列<400〉5GluValLysL.euGinGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPhe丁hrPheSerAsnTyr202530AlaMetSerTrpValGinThrProGluLysArgLeuGluTrpVsl354045AlaSerlieSerSerGlyGlyGlyThrTyrTyrProAspSerValLys505560GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnGlyArgAsnlieLeuTyrLeu65707580GinMetSerSerLeu85ArgSerGluAspThr90AlaMetPheTyrCysAla95ArgProTyrTyrTyrG]ySerSerTyrValSerPheAspValTrpGly100105110八laGlyThrThrValTh-rValSerSer115120<2i0〉6<211〉112<212〉PRT<213>VL编码l的氨基酸序列<400〉6AsplieValMetThrGinSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GinArgAlaThrI丄eSerCysArgAlaSerLysSerValSerAlaSer202530AspTyrSerTyrMetHisTrpTyrGinGinLysAlaGlyGinProPro354045LysLeuLeulieTyrLeuAlaSerAsnGluSerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrA印PheThrLeuAsnlieHis65707580ProValGluGluGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGinHisSerArg859095GluLeuProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLysArg100105110<210〉8<211〉1473<212>DNA<213〉重链基因IgH基因部分核苷酸序列<400>8tgcaggagtctggggg郷cttagtgaagcctggagggtccctg肌actc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagtsactatgccatgtcttgggttcgccsgact120ggctgg恥tgggtcgcatccattagtagtggtgggggcscctactatcca180鄉gccgattcaccatctccgcagga^catcctgtacctg240caaatgagcagtct.g郷tctg郷scacggccatgtttt3ctgtgcaagaccctattac300tacggtagtagct￡tcgtaXccttcgatgtxtggggcgc兆ggaccacggtcaccgtct.cc360tcagccaaaaC33C￡lgCCCCatcggtctatccactggcccctgtgtgtgg420ggctcctcggtgactctaggatgcctggtctccctgagccagtgaccttg480acctggaactctggatccctgtccagtggtgtgcacacctt,cccagctgt.cctgcagtct540gacctctacaccctcagcagctcagtgactgtaacctcgagcacctggcccagccagtcc600atcacctgca3tgtggCCC3cccggcaagc3gC3CC33gg犯ttgagccc660ctgt.cctcca"tgcaaatgcccctcttgggt720gga_ccatccgtcttcatcttccctcc肌agatcaaggatgtactcatgatctccctgagc780CCC3t3gtC3catgtgt船agcgaggatga_cccaga_tgtccagatcagc840tggUtgtgaacaacgtggagctcagacacagaggattac900肌cagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactgg3tg3gtggC960^gg邓ttcaaatgc犯ggtgacctcccagcgcccatcgagagaaccatc1020卿ggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctcc1080cactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagac1140stttacgtggca^cggga肌C3Ctg犯CC3120gtcctggactctgatggttcttacttcatgta_ca_gc^gctg柳gtgg3a犯ga^ga^c1260tgggtgg咖ctcctgttcagtggtccacgc犯tc3ccac1320gcttctcccggsctccgggt幼3tg3gCtCaaactctcag1380gtccaB3g3gtcatctccatgcttcccttggcacccagca14403tgCCtggg3ccatgtaaaaaaa1473<210〉8<211>880<212〉DNA<213〉轻链基因IgL基因部分核苷酸序列<400〉8tcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggcceicc60atctcatgcagggccagcaaaagtgtc兆tgcatctgactgcactggtac120c犯cag肌agcsggac8gcc3CCC肌3CtCctcatctatcttgcatccaacctggaatct180ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtCtggg3C3gacttcaccctcaacatccat240cctgtggaggag卵卿tgctactgtcagcgcttccgtgg300崎ttcggtggaggcaccaagctggaaatc肌acgggctgatgctgcaccaactgtatcc360atcttcccaccatccagtgatctggaggtgcctcagtcgtg"tgcttcttg420犯c肌cttct3CCCC犯3g3catcaatgtcttgatggcagtg朋cgacaa480犯tggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagc540agcaccctca^cgttgaccaa卿Cg兆t3tctgtgaggcc600csitc朋cttcacccattgtcaagagcttcagtgtt卿gs660ca^ggtcctgagacgcc3ccaccagctccccagctccatcctatcttcccttctaaggt720cttggaggcttccccacetagcgacctaccactgttgcggtgctccaaacctcctccccac780ctccttctcctcctcctccctttccttggcttttatcatgctaatatttg840gagtctttgc880权利要求1.一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。2.权利要求1所述的重链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqIDNo.5所示。3.—种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的轻链可变区基因，其核苷酸序列如SeqlDNo.2所示。4.权利要求3所述的轻链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.6所示。5.—种单链抗体的基因，其特征在于包括权利要求1所述的如SeqIDNo.l所示的重链可变区基因的核苷酸序列和权利要求3所述的如SeqIDNo.2所示的轻链可变区基因的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的单链抗体的基因，其核苷酸序列如SeqlDNo.3所示。7.权利要求5所述的单链抗体的基因编码的多肽。8.根据权利要求7所述的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.4所示。9.包含权利要求6所述的单链抗体的基因序列的表达载体pET-MC。10.权利要求2、4、7所述的多肽作为单链抗体在检测及定量微囊藻毒素中的应用。全文摘要本发明涉及“一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链与轻链可变区基因及其应用”，属于生物
技术领域：
。本发明提供一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因，并将两条基因重组后获得单链抗体基因，将该单链抗体基因构建载体并转化到大肠杆菌中，其表达产物具有抗原识别活性，能用于水体中微囊藻毒素的检测与监控。文档编号G01N33/577GK101429507SQ20081024030公开日2009年5月13日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者吴雅欣,周洪杰,宋丽敏,维张,敏林,潘家荣,许园园申请人:中国农业科学院原子能利用研究所