专利名称：一种鉴别单花蜂蜜真实属性的方法
技术领域：
本发明属于蜂蜜质量鉴定技术领域，具体涉及一种用不同技术指标两种数学模型对蜂蜜真实属性进行鉴定的方法。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。单花蜂蜜是指蜜蜂主要采集一种蜜源植物花蜜酿造的蜂蜜，只有花期长、 分布面积较大的蜜源植物才能形成商品单花蜜种。国内蜂蜜市场存在大量掺伪和假冒现象如玫瑰花蜜(玫瑰花雌蕊和雄蕊退化，没有蜜腺，不存在玫瑰蜂蜜)，党参蜜(党参花期短，分布窄不能形成较纯的单花蜂蜜，常由其他低质蜂蜜冒充)。蜂蜜真实性属性的核心是不得添加或混入来自蜂蜜以外的其他物质，包括可食用物质，也不能移去任何物质(包括水分)。我国的蜂蜜标准GB 18796-2005，基本解决了对用蔗糖、果葡糖浆、饴糖等人造假蜂蜜的鉴别，且对部分单花蜂蜜在色泽、气味、滋味和结晶状态等物理特性方面进行了推荐性要求，而对特有化学性质及检测方法没有说明。对单花蜂蜜的鉴别，业界传统使用的蜜源植物花粉鉴定法，是通过蜜蜂酿蜜过程中携带的少量蜜源植物花粉种类鉴定蜂蜜来源，而现行蜂蜜产品采用过滤工艺，商品蜜中一般不存在花粉； 蜂蜜品质快速检测方法(专利公开号CN 101391221A)，该专利用红外技术通过蜂蜜中小分子糖的种类和含量可判定某种食品是否是蜂蜜，没有解决如何区分不同种单花蜂蜜；一种蜂蜜真伪和品质鉴定检测方法(专利公开号CN 101871875A)，只能区别真蜂蜜和假蜂蜜， 不能判别伪劣蜂蜜(高品质蜂蜜中掺入低品质蜂蜜)。国内外现有分析技术，如液相、气相等主要用做蜂蜜样品中抗生素或农残等的分析使用(如基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，专利公开号 CN102183596A)。由于蜂蜜含有180多种组分，成分极为复杂，目前任何单一的技术方法仍无法准确的说明蜂蜜的真实性属性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用单花蜂蜜的基本理化属性和特征理化属性建立数学模型，对商品单花蜂蜜的真实植物来源、是否混杂其他低价蜂蜜等真实属性进行判定的方法。本发明的技术方案包括以下步骤(I)建立单花蜂蜜的标准样本；(2)测量待测蜂蜜样品的基本理化指标数据；(3)测量待测蜂蜜样品的特征物质组分数据；(4)采用主成分分析结合聚类分析来判定待测蜂蜜是否为所述单花蜂蜜；步骤(3)中，所述特征物质组分是通过将待测蜂蜜样品80°C加热60分钟，通过固相微萃取(SPME)富集，再用气相质谱联用(GC-MS)方法收集获得的极性、非极性小分子化合物。其中采集标准单花蜂蜜基本理化数据基本理化指标包括水分含量、电导率、pH值、酸度、羟基甲基糠醛(HMF)、还原性糖、葡萄糖、果糖、总蛋白含量、淀粉酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)。方法为还原糖含量(国家进出口标准SN/T 0852-2000)，葡萄糖和果糖(国家进出口标准SN/T 0852-2000)，pH值(AOAC)，酸度(国家进出口标准SN/T 0852-2000)，水分的含量(AOAC)，HMF (国家进出口标准 SN/T 0852-2000)，电导(GB/T 18932. 15-2003)，淀粉酶值(SN/T 0852-2000)。总蛋白采用考马斯亮蓝法测定。SOD活性参照罗广华方法。标准单花蜂蜜样品的收集是在蜜源植物盛花季节从各地蜂农手中直接购买的、未经任何加工的原始成熟蜂蜜样品，酿蜜蜂种为中华大黄蜂。市售标注为单花蜂蜜的商品蜂蜜不能作为标准单花蜂蜜样本收集。主成分分析结合聚类分析建立判定模型。先用主成分分析对标准单花蜂蜜样品中 11个基本理化指标进行降维处理，根据累计方差贡献率大于85%来提取主成分因子。再将提取的几个主成分作为变量，进行聚类分析。根据主成分分析和聚类分析的结果初步建立标准单花蜂蜜样本类群。采集标准单花蜂蜜特征理化数据采用固相微萃取结合气相质谱联用方法收集蜂蜜样品中极性、非极性小分子特征物质。固相微萃取头为PDMS\DVB、DVB\CAR\PDMS两种纤维头，样品收集条件为5g样品+2mL NaCl溶液+60min萃取时间+纤维头。色谱条件色谱柱为RTX-5MS石英毛细管色谱柱(3011^0.3211111^1.(^111)，柱温601(保留5min)，以 50C /min升温至220°C，保持IOmin ;汽化室温度250°C;载气为高纯(99. 999% )He ;载气流量l.Oml/min;无分流进样。质谱条件电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV ;传输线温度 2500C ;离子源温度为200°C ;质量扫描范围m/z 30 500。聚类分析建立判定模型。单花蜂蜜的典型性离子流如图1，通过检索Wiley7谱库和NIST 27谱库，鉴定出包括醇类、酮类、醛类、酸类、烷烃类、苯和呋喃衍生物等多种化合物。研究认为当某一化合物在所检测的单花蜜中都存在，而在其他检测的蜂蜜中不存在或存在但含量较少时，此化合物是该单花蜜的特征性物质。因而选择在各单花蜜中出现频次较高的化合物进行主成分分析和聚类分析。以累计方差贡献率达85%原则提取主要主成分分析。不同单花蜂蜜蜜种提取化合物不尽相同。根据特征物质主成分分析结合聚类分析结果建立标准单花蜂蜜的真实类群。待测蜂蜜样品真实性分析。测定待测样品蜂蜜上述(I)所述的十一个基本理化指标，根据主成分分析结合聚类分析结果观察待测样品蜂蜜所分布区域，初步判定待测样品与标准单花蜂蜜样品所属关系。若基本理化指标不能很好将待测样品蜂蜜分类，则按上述
(3)所述分析待测蜂蜜小分子特征化合物。根据蜂蜜特征物质主成分分析和聚类分析结果最终判定待测蜂蜜真实所属类群。
图I单花蜂蜜-沙枣蜜典型总离子流。图2四种单花蜂蜜蜜基本理化指标主成分结合聚类分析3四种单花蜂蜜特征物质组分的主成分分析荷载图
图4四种单花蜂蜜特征物质组分主成分结合聚类分析5基本理化指标提取的5个主成分相关矩阵的特征值
具体实施例方式为了更准确的评价市售单花蜂蜜的真实属性，以新疆地区大宗商品单花蜜种油菜蜜、沙枣蜜、葵花蜜，棉花蜜为标准建模样品，以油菜蜜、沙枣蜜、葵花蜜中添加20%棉花蜜为例说明该方法如何鉴别单花蜂蜜的真实属性。实施例一种鉴别单花蜂蜜真实属性的方法，具体包括以下步骤标准样品采集根据蜜源植物的分布特点和季节特性，收集蜂蜜样品共53份，主要来自南疆阿克苏、喀什，北疆石河子、昌吉、奎屯、阿勒泰、塔城、伊宁、乌鲁木齐，东疆木垒、吉木萨尔等地。在蜜源植物开花季节从蜂农手中直接购得。充分代表新疆四种单花蜂蜜特性。基本理化指标初步判断蜂蜜真实属性检测糖类、水分、电导、酸度、淀粉酶活性等 11种理化指标，根据一级蜂蜜国家标准要求，剔除水分含量过高，或酸度值较大，或其他单个指标不符合的样品。将获得的数据，根据特征值大于I的原则提取5个主成分，其特征值分别为2. 996,1. 530,1. 326,1. 225,1. 146，累计方差贡献率达74. 756%。从表2-2可知第一主成分Fl单独说明原始变量的27. 237%，代表变量为还原性糖、果糖、pH值、水分和电导。全部样品的主成分荷载如图5,棉花蜜位于第一主成份的负方向，除3个样品外,可以和其他三种单花蜜区分开。样品进行聚类分析，聚类如图2，从图中可以看出，同一植物来源的蜂蜜趋向于形成几个小类。4种单花蜂蜜特征理化数据的采集5g蜂蜜溶于2mLNaCl溶液，80°C恒温60min, 50/30 μ mDVB\CAR\PDMS萃取头吸附蜂蜜中溢出物质，然后将萃取头插入GC/MS进样口，于 250°C条件下解析5min后进样分析。4种蜂蜜样品共鉴定出144种化合物，主要包括醇类、 酮类、醛类、酸类、烷烃类、苯和呋喃的衍生物。乙醇、糠醛、安息香醛、苯乙醛、顺式氧化芳香醇、反式氧化芳香醇、苯乙醇、辛酸、乙酸苯乙酯、壬酸、大马酮、癸酸、十五烷、十二酸、十七烷、2，4，4，6-四甲基-2-庚烯、肉豆蘧酸、十八烷、异丙基豆蘧酸酯、十九烷、棕榈酸、棕榈酸乙酯、二十一烷、二十四烷和苯甲醇等25种化合物在四种单花蜜中都有检出，为不同单花蜂蜜的共有萃取物质。4种单花蜂蜜特征理化数据聚类分析蜂蜜中的特征性物质来源主要有两个途径直接来自蜜源植物花蜜腺；来自花蜜在蜂巢中逐步成熟过程中产生的新化合物。分析选择在各单花蜜种中出现频次较高的化合物进行主成分分析和聚类分析。以沙枣蜜为例。 选择在沙枣蜜中出现次数较高的39个代表性化合物进行主成分分析，所得的相关矩阵的根据特征值大于I的原则提取12个主成分，累计方差贡献率达82. 669%。第一主成分的代表变量为1_甲基_4_异丙烯基苯、苯乙醇、桃金娘烯醇、4_職品醇、職品醇、α，α， 4-三甲基-2，4-环己二烯-I-甲醇、异丙基豆蘧酸酯、2-莰烯、9-(3，3_ 二甲基-环氧乙烧-2-烧基)-2, 7_ 二甲基-九碳_2,6_ 二稀醇、2,4,4,6_四甲基_2_庚稀、3-苯基_2_丙烯醇、3-苯基丙烯醛。4种单花蜂蜜特征物质主成分荷载如图3。棉花位于第一主成分和第二主成分的负轴位置，能够很好的与其他三种单花蜜区分开。分别对单花蜂蜜的39个代表化合物进行聚类分析，如图4，棉花蜜等单花蜜能分别聚成小类。三种单花蜂蜜中掺20%棉花蜜的鉴别11种基本理化指标的测定结果表明，样品全部符合蜂蜜国家标准要求，但蜂蜜标准的符合不能说明混杂样品与单花蜂蜜样品的区别。进一步对基本指标的主成分分析结合聚类分析表明，混杂了棉花蜜的三种单花蜂蜜样品不能很好分布在本类别的单花蜂蜜类群内，如图2。蜂蜜特征组分的SPME结合GC-MS获得的数据，掺棉花蜜的各单花蜜萃取的物质类别和含量都有一定的变化，反应在PCA和聚类分析结果上就是与本类单花蜜聚类出现分支，样品落在靠近真实棉花蜜样品的区域，如图4方框内所标识。由上述实施例可见，判定某一单花蜂蜜的蜜源植物真实性来源、是否混杂其他蜂蜜种类，要在获得该单花蜂蜜的真实样本的基础上，分别建立该单花蜜基本理化指标和特征组分的主成分模型，并根据主成分的特征建立聚类模型，最后根据未知样品的PCA分析和聚类说明该样品是某一单花蜂蜜或某种混和蜂蜜的真实属性。
权利要求
1.一种鉴定单花蜂蜜真实属性的方法，包括以下步骤(1)建立单花蜂蜜的标准样本；(2)测量待测蜂蜜样品的基本理化指标数据；(3)测量待测蜂蜜样品的特征物质组分数据；(4)采用主成分分析结合聚类分析来判定待测蜂蜜是否为所述单花蜂蜜；其特征在于，步骤(3)中，所述特征物质组分是通过将待测蜂蜜样品80°C加热60分钟， 通过固相微萃取(SPME)富集，再用气相质谱联用(GC-MS)方法收集获得的极性、非极性小分子化合物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，通过采集单花蜂蜜的基本理化指标、特征物质组分的数据，来建立标准样本；其中，所述基本理化指标包括水分含量、电导率、pH、酸度、羟基甲基糠醛(HMF)、还原性糖、葡萄糖、果糖、总蛋白含量、淀粉酶活性和超氧化物歧化酶(SOD);所述特征物质组分是将标准单花蜂蜜样品通过固相微萃取(SPME)富集，再用气相质谱联用(GC-MS)方法收集获得的极性、非极性小分子化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基本理化指标包括水分含量、电导率、pH、酸度、羟基甲基糠醛(HMF)、还原性糖、葡萄糖、果糖、总蛋白含量、淀粉酶活性和超氧化物歧化酶(SOD)。
4.根据权利要求I至3中任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述主成分分析是将获得的待测蜂蜜的基本理化指标数据进行归一化处理，输入建立好的基本理化指标分析模型中，得到该待测样品的样本点，判断所述样本点落在分析模型中的区域，判定该待测样品的是否为所属单花蜜类群。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述聚类分析是将获得的待测蜂蜜的特征物质组分数据进行归一化处理，输入特征组分分析模型中，根据待测样本所在区域，最终判定该待测样品的真实属性。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别单花蜂蜜的方法，包括以下步骤建立单花蜂蜜的标准样本；测量待测蜂蜜样品的基本理化指标数据；测量待测蜂蜜样品的特征物质组分数据；采用主成分分析结合聚类分析来判定待测蜂蜜是否为所述单花蜂蜜。本发明的方法适用于对蜂蜜真假的鉴定，单花蜂蜜区别于其他单花蜂蜜，判定蜂蜜真实蜜源植物花蜜来源鉴定，单花蜂蜜掺杂其他低质蜂蜜的情况。
文档编号G01N1/34GK102607924SQ20121004898
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者李冠, 王咏星, 粟有志, 谢丽琼, 马东建 申请人:新疆大学
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