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专利名称：一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法
技术领域：
本发明属于海洋生物能源领域，具体涉及一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法。
背景技术：
微藻光合利用效率高、个体小、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、容易培养、不占用农业耕地，许多国家先后进行了微藻培养、营养价值分析及开发利用研究， 取得了许多成就和进展。特别是近几年，利用海洋微藻进行生物质能源的开发与应用吸引了许多研究者的重视。微藻细胞内的淀粉可以通过降解、发酵，最终转化为能被直接利用的能源，对此首先需要解决的一个重要问题是如何筛选富含淀粉的微藻以及如何通过优化培养微藻提高淀粉含量，其中淀粉含量的准确测定则是关键。目前，关于海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法未见报道。现有陆生植物中淀粉含量的测定方法主要归纳为碘直接显色法和还原糖间接测定法两大类。前者主要采用水作为淀粉提取剂，淀粉提取不彻底，干扰物质难以去除；后者国际上瑞典人J. Holm提出的快速分析测定淀粉的方法[1]，方法精准，但实验过程中样品需要先后经过α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶处理，三种酶国内难以同时购得，且价格昂贵。国内多采用蒽酮比色法和酶水解法(GB 5009. 9-85)，均是先将植物体内淀粉提取转化为还原糖，再通过定量测定还原糖含量间接计算淀粉含量，由于植物体内本身固有的还原糖不易除尽影响结果准确性，实验周期长、程序繁杂，这些不利因素给实验室分析操作带来诸多不便。

发明内容
本发明的目的即在于提供一种用于灵敏、快速、准确地实现微藻胞内淀粉提取及含量测定的技术方案。本发明所述的海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法包括如下具体步骤a.将待测微藻样品在3000 3500rpm离心3 8min得到微藻藻泥，用去离子水反复清洗3遍，以达到去除反应体系杂质的同时改变细胞内外的渗透压的目的；b.将步骤a所得的微藻藻泥反复冻融4 6次后，超声处理10 20min，使微藻细胞充分破碎，同时准确称重并记录质量；c.将步骤b所得的微藻藻泥与无水乙醇混合，振荡:3min后，3000 3500rpm离心 3 8min，收集沉淀；所述无水乙醇与步骤b中微藻藻泥的比例为6ml Ig ；d.向步骤c所得沉淀中加入沸程为60 90°C的石油醚，混合振荡5min后，继续加入90%乙醇，再混合振荡5min，在3000 3500rpm离心3 8min并收集沉淀；所述石油醚与步骤b中微藻藻泥的比例为細1 lg，所述乙醇与步骤b中微藻藻泥的比例为6ml lg；e.重复步骤d三次；f.向步骤e所得沉淀中加入0. 6 0. 8g/ml的硝酸钙溶液，煮沸10 30min后， 以充分提取微藻细胞内的淀粉，冷却至室温；所述的硝酸钙溶液与步骤b中微藻藻泥的比例为 IOml Ig ；g.向步骤f所得溶液中加入30%的过氧化氢，振荡反应20min后，加入0.05mol/L 盐酸，煮沸20min后冷却至室温；以消除残糖等还原性物质及脱色并赶出残留过氧化氢。所述30%过氧化氢的体积、0.05mol/L盐酸的体积与步骤b中微藻藻泥的比例均为aiil Ig ；h.步骤g所得溶液经过3000 3500rpm离心3 8min，收集上清液，沉淀再以f 步骤重复处理3 5次，合并所有上清液作为待测样品溶液；i.步骤h所得的待测样品溶液，与I2-KI标准溶液进行显色反应，于570nm波长下测定其吸光度值，利用淀粉标准曲线计算待测样品溶液中的淀粉含量。对于上述海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法，其中所述的步骤f中加入硝酸钙溶液的浓度，优选的为0. 8g/ml ；所述的步骤h中重复处理的次数，优选的为3次。本发明的上述技术方案针对海洋微藻细胞的物质组成特点，首先采用无水乙醇、 石油醚、90%乙醇对微藻细胞依次进行脱脂、脱色及脱糖处理，进而采用0. 6 0. 8g/ml的硝酸钙溶液作为微藻细胞内淀粉的提取剂，煮沸15 30min以充分提取微藻细胞内的淀粉，再采用过氧化氢氧化残余还原糖和消除残留色素并煮沸赶出过量的过氧化氢，最后以碘作为显色剂，利用分光光度法直接测定海洋微藻中的淀粉含量，其吸光值是直接以水为提取剂时的1. 3 1. 4倍，结果具有更好的准确性。本发明所述的上述方法中，淀粉标准曲线的绘制方法是本领域所公知的现有技术。本领域技术人员可以根据所能获得的条件来确定最适合的制备标准曲线的方案。无论以何种方法制备标准曲线，须严格地在同等条件下检测待测样品并计算其淀粉含量。本发明的具体实施方式
中，申请人采用以下方法制备淀粉标准曲线取不同体积的0. lg/L淀粉标准溶液，分别以与步骤f相同浓度的硝酸钙溶液补充至相同体积，然后以相同体积的 0. 01mol/L I2-KI标准溶液显色后于570nm波长下分别测定其吸光度值，最后以吸光度值对所取用淀粉标准溶液体积作图得标准曲线。本方法针对海洋微藻细胞的物质组成特点，在对海洋微藻进行简单预处理之后， 以碘作为显色剂，利用分光光度法直接测定海洋微藻中的淀粉含量，建立了直接定量测定海洋微藻细胞内淀粉含量的方法，与常用的陆生植物中淀粉含量的测定方法相比，过程简单，实验周期短，显色稳定时间长，结果准确，重现性好。


本发明附图1幅，即本发明实施例中制备的标准曲线。
具体实施例方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。可溶性淀粉，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；本发明涉及的海洋微藻均分离自渤海湾海域。
实施例1(一 )淀粉标准曲线的绘制准确称取0. IOg左右的分析纯淀粉，溶解于煮沸的去离子水中，冷却后定容至IL 容量瓶，制备成淀粉标准溶液；再量取不同体积的该淀粉标准溶液，分别用0. 8g/mL硝酸钙溶液补充至4ml，加0. 15mL 0. 01mol/L I2-KI标准溶液，摇勻，利用T6新世纪紫外可见分光光度计于570nm波长下分别测定其吸光度值，以的0. 8g/mL硝酸钙溶液加0. 15mL 0. 01mol/L I2-KI标准溶液作为空白，结果见下表1，以吸光度对淀粉标准溶液体积作图，见附图1。表1不同体积标准淀粉溶液的吸光度值
权利要求
1. 一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法，其特征在于包括如下步骤a.将待测微藻样品在3000 3500rpm离心3 8min得到微藻藻泥，用去离子水反复清洗3遍；b.将步骤a所得的微藻藻泥反复冻融4 6次后，超声处理10 20min，准确称重并记录质量；c.将步骤b所得的微藻藻泥与无水乙醇混合，振荡:3min后，3000 3500rpm离心3 8min,收集沉淀；所述无水乙醇与步骤b中微藻藻泥的比例为6ml Ig ；d.向步骤c所得沉淀中加入沸程为60 90°C的石油醚，混合振荡5min后，继续加入 90%乙醇，再混合振荡5min，在3000 3500rpm离心3 8min并收集沉淀；所述石油醚与步骤b中微藻藻泥的比例为細1 lg，所述乙醇与步骤b中微藻藻泥的比例为6ml lg；e.将步骤d重复三次；f.向步骤e所得沉淀中加入0.6 0. 8g/ml的硝酸钙溶液，煮沸10 30min后冷却至室温；所述的硝酸钙溶液与步骤b中微藻藻泥的比例为IOml Ig;g.向步骤f所得溶液中加入30%的过氧化氢，振荡反应20min后，加入0.05mol/L盐酸，煮沸20min后冷却至室温；所述30%过氧化氢的体积、0. 05mol/L盐酸的体积与步骤b 中微藻藻泥的比例均为anl Ig;h.步骤g所得溶液经过3000 3500rpm离心3 8min，收集上清液，沉淀再以f步骤重复处理3 5次，合并所有上清液作为待测样品溶液；1.步骤h所得的待测样品溶液，与I2-KI标准溶液进行显色反应，于570nm波长下测定其吸光度值，利用淀粉标准曲线计算待测样品溶液中的淀粉含量。
2.根据权利要求1所述的一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法，其特征在于所述的步骤f中加入硝酸钙溶液的浓度为0. 8g/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法，其特征在于所述的步骤h中重复处理的次数为3次。
全文摘要
一种海洋微藻细胞内淀粉含量的测定方法。本发明针对海洋微藻细胞的物质组成特点，首先采用乙醇、石油醚、90％乙醇对微藻细胞依次进行脱脂、脱色及脱糖处理，再采用0.6～0.8g/ml的硝酸钙溶液作为微藻细胞内淀粉的提取剂，煮沸15～30min以充分提取微藻细胞内的淀粉，其次采用过氧化氢氧化残余还原糖和残留色素并煮沸赶出过量的过氧化氢，最后以碘作为显色剂，利用分光光度法直接测定海洋微藻中的淀粉含量。该申请技术与常用的陆生植物中淀粉含量的测定方法相比，过程简单，实验周期短，结果准确，重现性好。
文档编号G01N1/28GK102323261SQ20111021863
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者于媛, 孟迎迎, 徐嫔, 杨海波 申请人:大连大学