专利名称：hIL-17RD-ECD单克隆抗体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体的制备和应用，尤其涉及一种hIL-17RD-E⑶单克隆抗体的制备及应用。
背景技术：
Thl7细胞分泌的IL-17包括IL-17A和IL-17F这两个炎症分子，他们都是通过 IL-17受体家族传递信号，从而影响下游基因表达的。白介素17受体家族(IL-17reC印tor) 是一种广泛存在于免疫活性细胞上的免疫性受体，能介导IL-17信号通路，具有很多重要的生理功能。目前已经发现了小鼠和人IL-17RD可以传递IL-17信号传导，并和IL-17RA 形成杂合二聚体。目前，对IL-17RA在基因克�。鞍妆泶锏确矫娑冀辛舜罅康难芯浚⑷〉昧撕艽蠼梗訧L-17RD的研究相对较少。IL-17RD在一次大规模的原位杂交中被发现，而此次原位杂交旨在筛选出在斑马鱼胚胎发育过程中空间限制基因。这些在类似的空间和时间表达的基因形成一个相互调控在共同通路中相互作用的家族。IL-17RD表达模式与成纤维细胞生长因子基因家族相似，而其表达也是受到FGFs调控的。自从IL-17RD首次从斑马鱼中被发现以来，在鸡，鼠，人类中其直系统同源都被鉴定出来。IL-17RD基因只存在于脊椎动物中，定位于单一的基因座。然而，通过可变联结机制形成了 IL-17RD异构体具有不同的生物化学和生物学特性。因此，进一步对IL-17RD的活性和作用机制的研究称为热点。
发明内容
本发明一个目的是提供一种保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞 (musmusculus hybridoma)1F8。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculushybridoma)1F8。本发明另一个目的是提供由保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞 (musmusculus hybridoma) 1F8 产生的单克隆抗体。本发明提供了由保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculushybridoma) 1F8产生的单克隆抗体。所述的单克隆抗体在制备白介素17受体D检测试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。所述的单克隆抗体在制备检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸条中的应用也是本发明保护的范围。含有所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的试剂盒也是本发明保护的范围。含有所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸条也是本发明保护的范围。
经筛选得到能稳定分泌抗人白介素17受体D(hIL_17RD)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F8，该杂交瘤细胞株1F8的分类命名为小鼠杂交瘤细胞mus musculushybridoma, 已于2011年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4576。本发明的实验证明，本发明筛选得到1株能稳定分泌抗人白介素17受体 D(hIL-17RD)的单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，以期进一步探讨 hIL-17RD基因与自身免疫疾病如类风湿性关节炎之间可能存在的相互关系及其功能的深入研究提供依据和奠定基�。票敢种评喾缡亟谘椎茸陨砻庖呒膊〉那痹谝┪锏鞍住�
图 1 为 hIL-17RD-ECD 蛋白的 SDS-PAGE 分析图2为阳性杂交瘤细胞特异性筛选图3为抗hIL_17RD的单克隆抗体的类型鉴定图4为腹水抗体效价的测定图5为单抗纯度及分子质量鉴定图6为Western blot检测内源hIL_17RD的结果图 7 为 Western blot 检测外源的 hIL_17RD 和 hIL_17RD_ECD
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、单克隆抗体的制备1、动物免疫人工合成hIL_17RD的胞外区蛋白(hIL_17RD_ECD，其核苷酸序列为序列表中的序列1所示，其氨基酸序列为序列表中的序列2所示，与GenbankNM_017563. 3的第1-739位核苷酸一致)的核苷酸序列作为模板，以IL-17RD-F_BamHI :atgcggatcccgccgacacctgtggc和 IL-17RD-R-PstI :aactgcagtcagtgatggtgatg 为引物，进行 PCR 扩增，得到的 PCR 产物经过 BamHI和I3StI酶切，与经过同样酶切的PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR载体(购自hvitrogen 产品目录10712024)大片段连接，得到连接产物，转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，转染步骤如下a、挑白斑提取转化子的质粒；b、转染在直径8cm的dish里均勻的铺(2. 5-3) X IO6个sf9细胞(购自武汉病毒所，sf9 cell)，细胞融合度为70%-80%。准备两个2ml的EP管，各加入IOOul的sf900 无血清培养基(Invitrogen，产品目录#10902096)，向其中一管中加入15ulCellfectin (转染试剂，购自hvitrogen，货号G4B2996936FB53)，另一管中加入2mg质粒，轻轻混勻，室温 (250C )静置5min然后将两管混在一起，室温(25°C )静置30min。加1. 8ml sf900培养基轻柔混勻，滴加在铺好的细胞表面，培养箱中静置证。在证后细胞基本贴壁，吸出培养基， 加入8ml新的无血清sf900。27°C静置培养10天，离心留上清，即为PO病毒。
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C、病毒扩增取50ul PO加入到50ml密度为(1. 5-2. 5) XlO6的sf9细胞中， 270C IOOrpm培养6天，离心收上清，即为Pl病毒，此时病毒滴度已可以感染细胞并大量表达蛋白。d、感染并表达蛋白用大的细胞培养瓶培养800ml sf9细胞，当细胞密度为 (1. 5-2. 5) X IO6且状态良好时，以1 100加入Pl病毒，27°C IOOrpm培养48-72h，收细胞。e、蛋白纯化将细胞培养物4000rpm离心lOmin，上清抽滤后浓缩，在此过程中换用 lysis buffer (IOmM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.5)浓缩到 200ml，离心 15000rpm35min, 收集上清加入1.5ml Ni-NTA，4°C摇动孵育池，使目标蛋白与Ni-NTA充分结合。孵育后， 使清液流过，加入含20mM咪唑的lysis buffer洗800ml，用15ml含500mM咪唑的lysis buffer洗脱目的蛋白，浓缩至800ul，使用AKTA和Superdex200分子筛层析柱(GE公司产品目录G4A90FD2ACFF64)进行进一步精细纯化，纯化后SDS-PAGE检测结果如图1所示，可以看出该蛋白大小为35KDa左右，即得到目的蛋白hIL-17RA-ECD(hIL-17RD胞外区蛋白；外源 hIL-17RD-ECD)。选6只8-12周龄Balb/C小鼠进行腹腔内免疫，初次免疫用80ug hIL_17RD胞外区蛋白加弗氏完全佐剂，两周后，用40ug hIL-17RD-E⑶加弗氏不完全佐剂强化免疫2次， 每次间隔2周，最后一次用hIL-17RD-ECD采用静脉注射强化免疫(不含佐剂)，3天后尾部采血，ELISA检测血清抗体效价。2、间接 ELISA 法用2ug/ml的抗原(hIL-17RD_ECD蛋白)IOOul/孔包被96孔板，4°C过夜后，用洗液洗涤3次，加150ul/孔封闭液在37°C封闭池，洗涤3次，拍干。加入待测样品(血清)， 第一孔1 1000稀释，往下1 3的梯度倍比稀释，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。取辣根酶标记的羊抗鼠IgG(bse-(^96G上海硕盟生物科技公司)按照1 5000倍稀释， IOOul/孔加入板子，37°C孵育30min，洗涤4次，拍干。最后加入IXTMB IOOul/孔，37°C显色15-30min。然后加入终止液(2M H2SO4) 50ul/孔。以450nm单波长测定各孔OD值，并用阴性对照孔PBS (GIBCO 21600-044,称量干粉4. 875g溶入500ml超纯水灭菌备用)OD值的比值(P/N)大于2. 1为限，作为判断阳性或者确定效价的临界点。结果为血清效价为1 720000的阳性小鼠，可以用于细胞融合。3、杂交瘤细胞融合筛选1)、融合前4天将阳性小鼠强化免疫，小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0比例为 10 1，PEG(分子量4000)融合，选择培养基为含HAT的RPMI640培养基。10天后，ELISA 筛选杂交瘤细胞上清，用有限稀释法对抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克�。酱紊秆∽钪杖范�13株细胞为阳性细胞。2)、特异性测定间接ELISA法检测所有阳性13株细胞是否能够特异识别hIL_17RD，以 hIL-17RD-E⑶(核苷酸序列为序列表中的序列1)和hIL-17RA-E⑶(其核苷酸序列为Gene ID :NM_017563的第1-897位核苷酸，制备方法与1中的hIL_17RD_E⑶基本相同。)为抗原，结果如图2所述，可以看出，只有一株命名为1F8的阳性细胞可以与hIL-17RD-E⑶特异结合，说明1F8可以特异识别hIL-17RD经筛选得到能稳定分泌抗人白介素17受体D(hIL_17RD)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F8，该杂交瘤细胞株1F8的分类命名为小鼠杂交瘤细胞mus musculushybridoma, 已于2011年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4576。4、单克隆抗体的生产及纯化1)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备采用动物体内生产单抗的方法。每只Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0. 5ml, 7天后，每只小鼠腹腔注射IX IO6个小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 1F8CGMCC No. 4576。7天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取腹水。腹水采集后 13000RPM离心IOmin除去油脂和沉淀，收集上清液，即为腹水单克隆抗体。2)纯化将腹水单克隆抗体用Binding Buffer (LS6510-10供应厂商Biovision)平衡 protein G(LS6510-10供应厂商=Biovision)至基线平稳，收集流穿液，然后将流穿液再次上柱，平衡至基线平稳。加入Eluting Buffer(LS6510-10供应厂商Biovision)洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的腹水单克隆抗体。二、单克隆抗体特性鉴定1、抗体类及亚类的鉴定用采用Southern Biotech 试剂盒(5300-01 southernbiotecti)鉴定单克隆抗体的亚类，结果如图3所示，杂交瘤细胞株1F8CGMCC No. 4576分泌的单克隆抗体的重链为 IgGl，轻链为Kappa型。2、ELISA效价的测定采用间接ELISA测定纯化的腹水单克隆抗体，2ug/ml的抗原(hIL-17RD_ECD蛋白)100ul/孔包被96孔板做ELISA，结果如图4所示，可以看出，纯化后效价为1 81000。3.抗体的分子质量鉴定采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体，结果如图5所示，单克隆抗体的重链约为 46KD，轻链约为25KD。4.单抗浓度测定紫外分光法测定单克隆抗体在^Onm和^Onm处的吸光度值A280和A260。蛋白含量按照下列公式计算蛋白质含量(g/L) = 1. 45XA280-0. 74XA260。结果为蛋白质含量为1.62mg/ml。实施例2、单克隆抗体的应用分别取昆明白小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司请提供出售公司及产品目录号)的脑、肾、肺，分别提取脑、肾、肺的蛋白；人工合成hIL-17RD(GenbankNM_017563. 3 的第 1-739 位核苷酸)， 以 IL-17RD-F-BamHI :atgcggatcccgccgacacctgtggc 禾口 IL-17RD-R-Ps11 aactgcagtcagtgatggtgatg为引物，得到的PCR产物经过BamHI和I3StI酶切，与经过同样酶切的PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR载体大片段的连接，得到连接产物，转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，转染步骤如下a、挑白斑提取转化子的质粒；
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b、转染在直径8cm的dish里均勻的铺(2. 5_3) X IO6个sf9细胞，细胞融合度为 70%-80%。准备两个2ml的EP管，各加入IOOul的sf900无血清培养基，向其中一管中加 15ul Cellfectin，另一管中加入2mg质粒，轻轻混勻，室温(25°C )静置5min然后将两管混在一起，室温)静置30min。加1. 8ml sf900培养基轻柔混勻，滴加在铺好的细胞表面，培养箱中静置证。在证后细胞基本贴壁，吸出培养基，加入8ml新的无血清sf900。 27°C静置培养10天，离心留上清，即为PO病毒。C、病毒扩增取50ul PO加入到50ml密度为(1. 5-2. 5) XlO6的sf9细胞中， 270C IOOrpm培养6天，离心收上清，即为Pl病毒，此时病毒滴度已可以感染细胞并大量表达蛋白。d、感染并表达蛋白用大的细胞培养瓶培养800ml sf9细胞，当细胞密度为 (1. 5-2. 5) X IO6且状态良好时，以1 100加入Pl病毒，27°C IOOrpm培养48-72h，收细胞。e、蛋白纯化将细胞培养物4000rpm离心lOmin，上清抽滤后浓缩，在此过程中换用 lysis buffer (IOmM HEPES, 150mM NaCl，pH 7. 5)浓缩到 200ml，离心 15000rpm35min，收集上清加入1.5ml Ni-NTA，4°C摇动孵育池，使目标蛋白与Ni-NTA充分结合。孵育后，使清液流过，加入含20mM咪唑的lysis buffer洗800ml，用15ml含500mM咪唑的lysis buffer 洗脱目的蛋白，浓缩至800ul，使用AKTA和SuperdeX200分子筛层析柱进行进一步精细纯化，SDS-PAGE检测结果，即得到较纯的目的蛋白纯化得到外源hIL-17RD。脑、肾、肺的蛋白、外源hIL-17RD、外源hIL_17RD_ECD(实施例1得到的hIL_17RD 胞外区蛋白)进行Wfestern blot分析，将蛋白经SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，将实施例1得到纯化的腹水单克隆抗体(1 10000)稀释作为一抗，HRP标记的羊抗鼠 IgG(bse-(^96G，上海硕盟生物科技公司)作为二抗。结果如图6和7所示，其中6为脑、肾、肺的蛋白的结果，从图中可以看出1脑，2 肾，3 肺中存在 hIL-17RD ；大小均为 130KD，这与 hIL_17RD (Gene ID :NM_017563 的第 1-897 位核苷酸)的大小一致。7为外源IL-17RD和外源的hIL_17RD_E⑶的检测结果，其中1为外源的 hIL-17RD，2为外源的hIL-17RD-ECD，从图中看出，可以检测出外源hIL-17RD (100KD)和 hIL-17RD-ECD(130KD)。检测得到的大小与已知蛋白的大小一致，证明本发明的单克隆抗体正确。
权利要求
1.保藏号为CGMCC No. 4576 的小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 1F8。
2.由保藏号为CGMCCNo. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 1F8产生的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备白介素17受体D检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸条中的应用。
5.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的试剂盒。
6.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸
全文摘要
本发明公开了一种hIL-17RD-ECD单克隆抗体的制备及应用。本发明提供的一种保藏号为CGMCC No.4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma)1F8。还提供了小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma)1F8产生的单克隆抗体。本发明的实验证明，本发明筛选得到1株小鼠杂交瘤细胞(mus musculushybridoma)1F8，并对其进行生物学特性鉴定，以期进一步探讨hIL-17RD基因与自身免疫疾病如类风湿性关节炎之间可能存在的相互关系及其功能的深入研究提供依据和奠定基�。票敢种评喾缡亟谘椎茸陨砻庖呒膊〉那痹谝┪锏鞍住�
文档编号G01N33/577GK102174475SQ201110039700
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者任芳丽, 夏永静, 孙小军, 常智杰, 杨世高, 王银银 申请人:清华大学
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