专利名称：Dlk1在肝癌诊断及预后判断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及DLKl在肝癌诊断及预后判断中的应用。
背景技术：
DLKl (Delta-like I homologue)，也被称为 Pref-I (前脂肪细胞因子-I)，是首先在神经母细胞瘤发现并克隆的基因(Laborda J et al，J Biol Chem，1993，268 (6)3817-3820)，定位于人染色体人14q32。DLKl蛋白在细胞分化方面起到一定的作用，尤其在内胚层起源的肝细胞、呼吸道上皮细胞中有表达，随着胎儿胎龄的增加，正常组织中DLKl的表达逐渐减少。
人基因Dlkl (GeneBank登录号BC007741)全长1557bp，开放阅读框含有1152个核苷酸，编码383个氨基酸残基。DLKl蛋白是一种跨膜蛋白，包含细胞内信号肽，中间跨膜区及细胞外区，其中细胞外区由6个表皮生长因子样(epidermal growth factor-likerepeat, EGF-Iike repeat)串联重复组成。因此DLKl属于EGF样超家族的成员之一。DLKl蛋白通过胞外结构域的糖基化以及同源和异源二聚体来调节其细胞生物学活性，根据其糖基化程度的不同，DLKl蛋白的分子量约在45-60kD之间。其胞外结构域上有两处蛋白酶加工的位点，在跨膜区近侧，经蛋白酶作用后，会产生分泌性蛋白片段，释放到细胞外发挥其生物学效应。DLKl在人和啮齿类胚肝中高表达，但成体肝组织中无表达。DLKl与肝脏纤维化甚至肝硬化密切相关。有报道称，在小鼠中DLKl可以作为一个肝干细胞标志富集肝母细胞，而且DLKl阳性的肝细胞可进一步分化成为肝细胞和胆管上皮细胞(Oertel M et al,Gastroenterology，2008 :134 :823-832 ;Tanimizu N et al, J Cell Sci，2003 :116 :1775-1786)。目前发现DLKl在多种肿瘤中的表达上调，其中包括小细胞肺癌(Laborda Jet al,J Biol Chem，1993 :268 :3817-3820)、神经内分泌肿瘤(Yin D etal, Oncogene, 2006 25 1852-1861)和肝癌(Jin ZH et al, Expert Opin Biol Ther 2008 :8 :371-377 ;Dezso Ket al, Virchows Arch, 2008 :452 :443-448 ；Huang J et al, Carcinogenesis, 2007 :28 1094-1103)等。本发明人前期研究表明，DLKl在肝癌组织中的表达显著上调(71.9%)，而且外源性表达DLKl可以明显促进肝癌细胞系的体外增殖和裸鼠体内成瘤能力(Yu Fet al,Liver International,2010 :1478-3223)。原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断以及预后判断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查等方法，然而这些检测方法均具有一定的局限性。例如即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。癌症的血清学检测技术一直是研究的重点。然而，目前现有的针对癌症(如HCC)检测尚缺乏令人满意的血清标志物，更缺乏可用于血清检测或肝癌预后检测的血清标志物。因此，本领域迫切需要开发可用于血清检测或肝癌预后检测的血清特异标志物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于血清检测或肝癌预后检测的血清特异标志物。在本发明的第一方面，提供了前脂肪细胞因子-UDLKl蛋白)或其特异性抗体的用途，它被(a)用于制备肝癌预后检测的诊断试剂或试剂盒；或(b)用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的DLKl蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位 素或酶。在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的肝癌预后检测是血清检测。在另一优选例中，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA 法)。在另一优选例中，所述的DLKl蛋白包括全长DLKl蛋白、或其分泌性蛋白。在另一优选例中，人DLKl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。在另一优选例中，人DLKl蛋白的分泌性蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :2中第24-303 位。在本发明的第二方面，提供了一种用于肝癌预后检测的诊断试剂盒，其中所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有DLKl蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肝癌或肝癌预后检测。在另一优选例中，所述的DLKl蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容(i)如果检测对象的血清DLKl浓度彡1000pg/ml (较佳地彡1500pg/ml,更佳地^ 2000pg/ml)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群；和/或(ii)如果检测对象的血清DLKl浓度彡890pg/ml (较佳地彡1000pg/ml,更佳地^ 1200pg/ml)，则该对象的肝癌预后较差，即该对象的生存期短于一般肝癌患者(或DLKl阴性的肝癌患者)生存期的概率高。在另一优选例中，进行肝癌预后检测的对象是肝癌患者。在另一优选例中，所述的DLKl阴性的肝癌患者指血清DLKl浓度< 890pg/ml，较佳地< 700pg/ml,更佳地< 600pg/ml。在另一优选例中，所述肝癌包括肝细胞肝癌，尤其是原发性肝细胞肝癌。在另一优选例中，所述的DLKl蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体。在本发明的第三方面，提供了一种前脂肪细胞因子-UDLKl蛋白)的用途，它被用作肝癌预后检测的标志物。在另一优选例中，所述的检测是血清检测。在本发明的第四方面，提供了一种前脂肪细胞因子-UDLKl蛋白)的拮抗剂的用途，它被用于制备提高肝癌预后的药物。在另一优选例中，所述的拮抗剂包括针对DLKl的siRNA、反义RNA、抗体、或其组
口 o
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I显示了 DLKl的氨基酸序列(SEQ ID NO. :2)，其中DLKl分泌性蛋白位于第24-303 位。图2显示了肝癌患者血清中DLKl浓度明显高于健康对照组(P < 0. 05)。图3显示了血清DLKl的ROC曲线。其中，ROC曲线下面积为0. 512±0. 029 (95%可信区间为0. 455和0. 570)。cut-off值(阈值)设定在890pg/ml以区分健康对照组和肝癌患者，其敏感性和特异性分别为33. 2%和75. 0%。箭头指示血清DLKl的阈值(cut-off)为 890pg/mlo图4显示了肝癌患者生存期分析。其中DLKl < 890pg/ml为0 ;DLK1彡890pg/ml为I。结果表明，DLKl阴性的患者生存期明显长于DLKl阳性的患者(P = 0. 033)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，肝癌患者血清中DLKl浓度或水平与肝癌患者的Edmondson组织学分级、肿瘤大小以及生存期等有明显的相关性(P<0.05)。因此，DLKl可作为新的肝癌血清标志物，用于肝癌的诊断与预后判断。在此基础上完成了本发明。DLKl蛋白和基因人基因Dlkl (GeneBank登录号BC007741)全长1557bp，开放阅读框含有1152个核
苷酸，编码383个氨基酸残基。在本发明中，术语“本发明蛋白”、“DLK1蛋白”、“DLK1多肽”或“Delta样蛋白DLK1”可互换使用，都指具有人DLKl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2或图I) (GENE登录号NP_003827)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的DLKl蛋白。此外，该术语还包括全长的DLKl及其片段，尤其是分泌性片段(或分泌性蛋白)。本发明所指的DLKl蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。DLKl分泌性蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. :2中第24-303位。此外，本发明的DLKl蛋白包括糖基化和非糖基化的蛋白。在本发明中，术语“DLK1基因”、“DLK1多核苷酸”或“前脂肪细胞因子-I基因DLK1”可互换使用，都指具有人DLKl核苷酸序列(SEQ ID NO 1 ;或GeneBank登录号BC007741)的核酸序列。其中ORF位于SEQ ID NO. :I的205位-1356位。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。在得到了 DLKl的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的DLKl核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的DLKl多肽。一般来说有以下步骤(I).用本发明的编码人DLKl多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，DLKl多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质�：驮靥宥伎梢杂谩１泶镌靥宓囊桓鲋匾卣魇峭ǔ：懈粗破鸬�、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DLKl编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 o特异性抗体在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗DLKl的特异性抗体”可互换使用。本发明还包括对人DLKl多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人DLKl基因产物或片段。较佳地，指那些能与人DLKl基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人DLKl蛋白的分子，也包括那些并不影响人DLKl蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人DLKl基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No. 4，946，778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人DLKl基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人DLKl蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。本发明的抗体包括能阻断人DLKl蛋白功能的抗体以及不影响人DLKl蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人DLKl基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人DLKl基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E. Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗人DLKl蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人DLKl蛋白。检测方法利用DLKl存在于血清中，且与肝癌预后密切相关这一特点，本发明还提供了血清检测或肝癌预后检测的方法，尤其是血清学检测方法。在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血清DLKl的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。检测试剂盒本发明还提供了一种肝癌血清检测或肝癌预后检测的试剂盒，它含有本发明的抗DLKl的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。本发明的人肝癌血清学诊断试剂盒，已完成实验上百例。 用本发明的人肝癌预后的血清学诊断试剂盒检测为阳性的对象，其肝癌生存期明显短于DLKl阴性患者。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的DLKl的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于提高肝癌患者的生存期。在本发明中，所述的拮抗剂包括针对DLKl的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。此夕卜，所述的拮抗剂还包括可以降低DLKl表达或活性的小分子化合物。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。本发明的药物组合物可直接用于抑制肝癌细胞的转移。此外，还可与其他肿瘤治疗剂联用。本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的DLKl拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针齐U、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的DLKl拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的主要优点包括(I)首次提供了通过血清标志物检测和进行肝癌预后的方法，有助于准确地判断肝癌患者的生存期，从而有助于尽早采取相应治疗措施。(2)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。(3)便于动态监察HCC患者的病情进展。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实验方法血清中DLKl蛋白的ELISA检测血清中DLKl 的浓度测定均按照 R&D 公司 Quantikine HumanPref-1/DLK-l/FAlImmunoassay (DPRFlO)说明书进行,方法如下I)每孔加100 U I稀释液。2)每孔加50 U I适当稀释的标准品和待测血清样品，贴上封板膜，室温孵育2小 时。其中，待测血清样品的稀释度为I : 10。3)吸干每一孔的液体并加400 U I洗液洗涤，重复3次。最后一次，将板中液体移出并将酶标板在干净的纸巾上吸附。4)每孔加200 U I DLK-I标记抗体，贴上新的封板膜,室温孵育2小时。5)重复步骤3。6)每孔加200 U I底物，避光，室温孵育30分钟进行显色反应。7)每孔加50 U I终止液，轻轻振荡酶标板确保充分混匀。8)在30分钟内在酶标仪上采用450nm波长对结果进行判读。9)数据分析和计算。数据处理实验获得数据按常规方法进行整理和统计分析。计量数据以平均值土标准差的形式表示，采用Student’s t_test分析其统计学意义；分类数据采用Chi-square检验。统计检验得到的概率P < 0. 05认为具有统计学意义。实施例I血清中DLKl蛋白浓度在肝癌患者中明显升高本实施例中，通过ELISA方法检测了 400例肝癌患者和88例健康对照组血清中DLKl的浓度。结果表明，在HCC血清中DLKl的浓度为2378.6±337.5pg/ml (平均数土SD);健康对照组血清中DLKl的浓度为685. 4±38. 9pg/ml (平均数土SD)，肝癌患者血清中DLKl浓度明显高于健康对照组(P < 0. 05)(图2)。因此，如果被检测对象的血清中DLKl的浓度彡1000pg/ml (更佳地彡2000pg/ml)，则提示该对象患肝癌的几率明显大于正常人群。实施例2血清DLKl浓度与各项临床指标的关系为进一步探索血清DLKl浓度与各项临床指标的关系，根据ROC曲线(图3)设定7 DLKl的cut-off值(阈值)为890pg/ml，其敏感性和特异性分别为33. 2%和75. 0%，阳性率约为22% (29/132)。纳入统计分析的临床病理指标主要有患者性别、年龄、血清甲胎蛋白、乙肝病毒表面抗原、肿瘤大小、Edmondson组织学分级、肝内转移和伴发肝硬化。统计分析结果显示，血清DLKl浓度与肝癌患者Edmondson组织学分级以及肿瘤大小等指标密切相关(表I)。表I.血清DLKl浓度与肝癌患者临床病理指标的相关性分析
权利要求
1.前脂肪细胞因子-UDLKl蛋白)或其特异性抗体的用途，其特征在于，(a)用于制备肝癌预后检测的诊断试剂或试剂盒；(b)用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的DLKl蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂是单克隆抗体。
5.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的肝癌预后检测是血清检测。
6.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的DLKl蛋白包括全长DLKl蛋白、或其分泌性蛋白。
7.一种用于肝癌预后检测的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有DLKl蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肝癌或肝癌预后检测。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的DLKl蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
9.一种前脂肪细胞因子-UDLKl蛋白)的用途，其特征在于，它被用作肝癌预后检测的标志物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的检测是血清检测。
全文摘要
本发明涉及一种DLK1在肝癌诊断及预后判断中的应用。具体地，本发明提供了前脂肪细胞因子-1(DLK1蛋白)在(a)制备肝癌预后检测的诊断试剂或试剂盒以及(b)制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明还提供了相应检测试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102778566SQ20111011739
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月7日 优先权日2011年5月7日
发明者李红, 李锦军, 葛超 申请人:上海市肿瘤研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
