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专利名称：Fret测量方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过激光照射供体分子(第一分子)接收能量、能量从供体分子转移到受体分子(第二分子)的FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer:蛮光共振會邑量转移)的测量方法及装置。具体来说，涉及关于供体分子和受体分子的对，通过荧光测量两个分子之间的相互作用的FRET测量技术。
背景技术：
目前，作为医疗、制新药、食品产业中后基因的相关技术，蛋白质的功能分析变得越来越重要。特别是，为了分析细胞作用，需要研究活细胞中活体物质的蛋白质与其它蛋白质或低分子化合物之间的相互作用(结合、分离)。利用荧光共振能量转移(FRET)现象对活细胞中活体物质的蛋白质和其它蛋白质或低分子化合物之间的相互作用进行分析。对通过FRET现象产生的荧光进行测量，由此能够对几纳米波段中的分子间的相互作用进行测量。例如，公开了一种利用FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ 和受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ d求出表示从供体分子向受体分子的能量转移程度的FRET效率的技术(专利文献1)。在上述专利文献1中FRET效率通过1 一 τ *d/ τ d求出。专利文献1 特开2007-240424号公报

发明内容
但是，上述FRET效率受到相对于供体分子浓度的受体分子浓度比例的影响，因此利用上述技术难以定量求出包含在细胞等的蛋白质的相互作用的强度。因此，本发明的目的在于提供一种不受相对于供体分子浓度的受体分子浓度比例的影响的情况下能够定量进行FRET测量的FRET测量方法及装置。为了解决上述课题，本发明的FRET测量方法将激光照射在用第一分子和第二分子进行标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括如下步骤最短荧光寿命计算步骤，相对于第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值； 照射步骤，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；测量步骤，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；第一分子荧光寿命计算步骤，利用所述测量步骤中被测量的荧光信号计算出第一分子的荧光寿命；FRET发生率计算步骤，利用在所述最短荧光寿命计算步骤中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和计算出的所述第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。另外，所述FRET发生率计算步骤优选的是在所述FRET发生率计算步骤中进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。另外，本发明的FRET测量方法包括观察矩阵计算步骤，在该步骤中从所述测量步骤中测量的荧光信号，计算出在所述照射步骤中用于求出第一分子被激光照射而发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，所述观察矩阵计算步骤优选包括第一步骤，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号求出所述矩阵成分的一部分；第二步骤，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号求出所述矩阵成分的一部分。另外，本发明的FRET测量方法优选的是包括解离常数计算步骤，在该步骤中利用所述FRET发生率计算步骤中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子结合情况的解离常数。另外，计算所述第一分子荧光寿命的步骤优选的是利用所述测量步骤中被测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。另外，在所述第一步骤中，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分，在所述第二步骤中，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分。另外，本发明的FRET测量方法包括第一分子浓度计算步骤，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；第二分子浓度计算步骤，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子浓度；在所述解离常数计算步骤中优选的是，利用在所述第一分子浓度计算步骤中计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算步骤中计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。另外，为了解决上述课题，本发明的FRET测量装置将激光照射在用第一分子和第二分子标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括激光光源部，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；测量部， 测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；荧光寿命计算部，利用所述测量部测量的荧光信号计算出第一分子荧光寿命；最短荧光寿命计算部，利用第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品中的第一分子荧光寿命，计算出第一分子荧光寿命的最小值；FRET发生率计算部，利用在所述最短荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和在所述荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。另外，所述FRET发生率计算部优选的是进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。另外，本发明的FRET测量装置包括观察矩阵计算部，在该步骤中从所述测量部中测量的荧光信号计算出用于求出在所述照射步骤中通过激光照射而第一分子发出的荧光的信息和第二分子发出的荧光的信息的矩阵，在所述观察矩阵计算部，优选的是，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。另外，本发明的FRET测量装置优选的是包括解离常数计算部，在该部中利用在所述FRET发生率计算部中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子的结合状况的
解离常数。另外，所述荧光寿命计算部优选的是利用在所述测量部测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。另外，优选的是，所述观察矩阵计算部利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光，用所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光，用所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分。另外，优选的是，本发明的FRET测量装置包括第一分子浓度计算部，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；第二分子浓度计算部，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子的浓度；所述解离常数计算部利用在所述第一分子浓度计算部计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算部计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。根据本发明的FRET测量方法以及装置，在不受相对于供体分子的浓度的受体分子的浓度比的影响下能够定量进行FRET测量。


图1为本发明的FRET测量装置的一个实施方式的流式细胞仪的概略构成图；图2为表示供体分子和受体分子的能量吸收光谱和荧光发射光谱的一例的图；图3为表示图1所示的流式细胞仪的测量部的一例的概略构成图；图4为表示图1所示的流式细胞仪的控制和处理部的一例的概略构成图；图5为表示图1所示的流式细胞仪的分析装置的一例的概略构成图；图6为表示FRET测量流程的一例的图；图7为表示FRET效率和α关系的图；图8为表示FRET发生时的荧光发光动力学的模式图；图9为表示观察矩阵的测量例的图；图10为测量最大FRET效率和最短荧光寿命的流程图的一例；图11为测量观察矩阵的流程图的一例；图12为样品测量的流程图的一例。符号说明10流式细胞仪12 样品20 管道22回收容器30激光光源部
40、50测量部
51透镜系统
52分色镜
53、54带通滤波器
55、56光电转换器
100控制和处理部
110信号生成部
112振荡器
114功率分配器
116、118放大器
120信号处理部
122、IM放大器
126相位差检测部
130控制部
132低通滤波器
134放大器
136A/D转换器
138系统控制部
150分析装置
152CPU
154存储器
156输入输出端口
158荧光寿命计算单元
160FRET效率计算单元
162最短荧光寿命计算单元
164FRET发生率计算单元
166观察矩阵计算单元
168第一分子浓度计算单元
170第二分子浓度计算单元
172解离常数计算单元
200显示器
具体实施例方式下面，对本发明的FRET测量方法和装置进行详细说明。图1为本发明的FRET测量装置的一个实施方式的流式细胞仪10的概略构成图。本发明的流式细胞仪10例如将激光照射在由供体分子和受体分子标记作为测量对象的活细胞中的蛋白质的样品12 (测量样品)上，并测量样品12发出的荧光。流式细胞仪10通过利用被测量的荧光信号求出在供体分子中发生FRET的供体分子的比例的κ FKET。 进一步，流式细胞仪10除了 Kfket之外还求出供体分子的浓度、受体分子的浓度、解离常数K d的值。如图1所示，流式细胞仪10包括管道20、激光光源部30、测量部40、50、控制和处理部100、分析装置150。在管道20中，使形成高速流的鞘液与样品12—起流动。在管道20的出口处设置有回收样品12的回收容器22。激光光源部30向样品12照射对强度进行了时间调制的激光。通过向样品12照射激光，供体分子和受体分子分别吸收能量。例如，供体分子为CFP (Cyan Fluorescent Protein)、受体分子为YFP (Yellow Fluorescent Protein)时，使用供体分子主要吸收能量的波长为405ηπΓ450ηπι的激光。激光光源部30为例如半导体激光激光器。激光光源部 30发射的激光的输出为例如5mW 100mW。在此，对激光光源部30照射的激光的波长和供体分子以及受体分子吸收能量的波长的关系、以及FRET的发生进行说明。图2为表示供体分子为CFP、受体分子为YFP时的能量吸收光谱和荧光发射光谱的图。曲线A1为供体分子的能量吸收光谱，曲线A2为供体分子荧光发射光谱。另外，曲线B1 为受体分子的能量吸收光谱，曲线B2为受体分子的荧光发射光谱。如图2所示，供体分子主要吸收能量的波段为405nnT450nm。另外，受体分子主要吸收能量的波段为470歷 530歷。一般来说，当供体分子和受体分子的距离为2nm以下时，通过激光照射供体分子吸收的能量的一部分通过库伦相互作用向受体分子移动。受体分子吸收通过库伦相互作用从供体分子转移的能量而被激发，由此发出荧光。该现象被称之为荧光共振能量转移 (FRET)。作为供体分子使用CFP，作为受体分子使用YFP时也发生FRET。即，通过库伦相互作用能量从供体分子向受体分子转移，由此受体分子被激发而发出荧光。进一步，如图2所示，供体分子的能量吸收光谱A1和受体分子的能量吸收光谱B1 部分重叠。因此，受体分子发出通过激光直接激发而导致的荧光。再返回图1，测量部40按照夹着管道20与激光光源部30相对而置的方式配置。 测量部40包括光电转换器，通过在测量点上通过的样品12使激光发生前向散射，由此输出样品12通过测量点的检测信号。从测量部40输出的信号供给到控制和处理部100。从测量部40供给到控制和处理部100的信号作为通知样品12通过管道20中的测量点的时间的触发信号来使用。测量部50配置在通过测量点、相对于发射自激光光源部30的激光发射方向呈正交的平面和通过测量点、相对于管道20中的样品12移动方向呈正交的平面的交线上。测量部50包括光电倍增管或雪崩光电二极管等光电转换器，以接收样品在测量点被激光照射后所发出的荧光。在此，参照图3详细说明测量部50的构成。如图3所示，测量部50包括透镜系统 51、分色镜52、带通滤波器53、54、光电转换器55、56。透镜系统51将样品12发出的荧光进行聚焦。分色镜52按照将受体分子发出的荧光进行透射、将供体分子发出的荧光反射的方式设定反射、透射波长。带通滤波器5354被设置在光电转换器55、56的受光面的前面，带通滤波器53、54 仅使具有规定波段的荧光透射。具体来说，带通滤波器53按照透射主要是供体分子发出荧光的波段(图2中的由A表示的波段)的荧光的方式设定。另外，带通滤波器M按照透射主要是受体分子发出荧光的波段(图2中的由B表示的波段)的荧光的方式设定。在下面的说明中，在图2中由A表示的波段称之为“供体波段”，由B表示的波段称之为“受体波段”。另外，如图2所示，表示供体分子的荧光发射光谱的曲线A2通过受体波段，表示受体分子的荧光发射光谱的曲线4通过供体波段。因此，在按照透射供体波段的荧光的方式设定的带通滤波器53中，不仅透射供体分子发出的荧光，也少量地透射受体分子发出的荧光。同样，在按照透射受体分子发出的荧光的方式设定的带通滤波器M中，不仅透射受体分子发出的荧光，也少量地透射供体分子发出的荧光。如后面所述，分析装置150利用观察矩阵校正包含各波段上漏泄的荧光的荧光信号，并求出供体分子发出的荧光的信息和受体分子发出的荧光的信息。光电转换器55、56将所接收的光转换成电信号。光电转换器55、56为包括例如光电倍增管的传感器。光电转换器55、56所接收的荧光比强度调制的激光相位滞后。因此， 光电转换器阳、56接收具有相对于强度调制的激光的相位差信息的光信号，并将其转换成电信号。从光电转换器阳、56输出的信号(荧光信号)供给到控制和处理部100。在此，参照图4详细说明控制和处理部100的构成。如图4所示，控制和处理部 100包括信号生成部110、信号处理部120、控制部130。信号生成部110生成用于将激光强度进行时间调制的调制信号。调制信号为例如规定频率的正弦波信号，被设定为IOMHflOOMHz的范围的频率。信号生成部110包括振荡器112、功率分配器114、放大器116、118。通过振荡器 112生成的调制信号通过功率分配器114分成后供给到激光光源部30和信号处理部120。 信号生成部110将调制信号供给到信号处理部120，这是因为如后所述，作为测量相对于调制信号的荧光信号的相位差的参照信号来使用。另外，调制信号作为用于调制激光光源部 30发射的激光振幅的信号使用。信号处理部120利用从光电转换器55、56输出的荧光信号，抽样样品12发出的荧光的信息。样品12发出的荧光信息为例如与荧光强度相关的信息或与荧光寿命相关的信息。信号处理部120包括放大器122、124、相位差测量器126。放大器122、IM将从光电转换器55、56输出的信号进行放大，将被放大的信号输出至相位差检测器126。相位差检测器1 针对从光电转换器55、56输出的各荧光信号检测出相对于调制信号的相位差。相位差检测器1 包括未图示的IQ混频器。IQ混频器通过将参照信号和荧光信号相乘来计算出包含荧光信号的cos成分(实数部)和高频成分的处理信号。另外， IQ混频器通过将参照信号的相位位移90度后的信号和荧光信号的相乘来计算出包含荧光信号的sin成分(虚数部)和高频成分的处理信号。控制部130按照信号生成部110生成具有规定频率的正弦波信号的方式控制信号生成部110。另外，控制部130从通过信号处理部所输出的包含荧光信号的cos成分和sin 成分的处理信号中去除高频成分而求出荧光信号的cos成分和sin成分。控制部130包括低通滤波器132、放大器1!34、A/D转换器136、系统控制器138。低通滤波器132从信号处理部输出的包含荧光信号的cos成分、sin成分和高频成分的信号中去除高频成分。放大器134对通过低通滤波器132去除高频成分的信号的荧光信号的cos成分、sin成分的处理信号进行放大，并将其输出至A/D转换器136。A/D转换器136将对荧光信号的cos成分、sin成分的处理信号进行取样，并供给至分析装置150。系统控制器 138接收将从测量部40输出的触发信号的输入。另外，系统控制器138控制振荡器112和 A/D转换器136。分析装置150从荧光信号的cos成分(实数部)、sin成分(虚数部)的处理信号计算出荧光寿命、FRET效率、最短荧光寿命、FRET发生率、观察矩阵、供体分子的浓度、受体分子的浓度、解离常数等。分析装置150是在计算机上使规定程序启动的装置。图5为表示分析装置150的概略构成图。如图5所示，分析装置150包括CPU152、存储器154、输入输出端口 156、荧光寿命计算单元158、FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、 解离常数计算单元172。另外，在分析装置150上连接有显示器200。CPU152为设置在计算机上的运算处理器。CPU152实质地执行荧光寿命计算单元 158、FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、解离常数计算单元172的各种计算。存储器巧4包括R0M，存储有通过在计算机上执行来形成荧光寿命计算单元158、 FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、解离常数计算单元 172的程序；RAM，存储通过这些单元计算的处理结果或从输入输出端口 156供给的数据。输入输出端口 156用于接收提供自控制部130的荧光信号的cos成分(实数部)、 sin成分(虚数部)的值的输入。另外，输入输出端口 156将通过各单元计算出的处理结果输出到显示器200上。显示器200显示通过各单元求出的各种信息或处理结果等。荧光寿命计算单元158利用通过测量部50测量的荧光信号计算出供体分子的荧光寿命。例如，荧光寿命计算单元158从由控制部130供给的荧光信号的cos成分以及sin 成分的值求出相对于调制信号的荧光信号的相位差。另外，荧光寿命计算单元158利用所求出的相位差计算出供体分子的荧光寿命、受体分子的荧光寿命。具体来说，荧光寿命计算单元158通过将相位差的tan成分用调制信号的角频率相除来计算荧光寿命。荧光寿命由被激光照射而发出的荧光成分为一次滞后系统的弛豫响应时的荧光弛豫时间常数表示。进一步，荧光寿命计算单元158计算出后述的受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ D、FRET发生时的供体分子的平均荧光寿命τ \、受体分子的荧光寿命τ Α。FRET效率计算单元160利用在荧光寿命计算单元158计算出的受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命td、FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ *D，计算出表示根据FRET 的能量转移程度的FRET效率Ε*。具体来说，FRET效率计算单元160计算由后述的式(14) 规定的FRET效率Ε*。最短荧光寿命计算单元162计算作为FRET效率Ε*的最大值的最大FRET效率Emax。 如后述，FRET效率E*根据由式(16)定义的活细胞中的供体分子的浓度Cd[M]和受体分子的浓度Ca[M]之比α进行变化。最短荧光寿命计算单元162利用FRET效率计算单元160 相对于多个α计算出的FRET效率Ε*的结果，计算出最大FRET效率^liaxtl另外，如后述的式(18)所示，如果最大FRET效率^iax被定下来，则作为供体分子的荧光寿命的最小值的最短荧光寿命τ Dmin也被定下来，最短荧光寿命计算单元162利用计算出的最大FRET效率^liax计算出最短荧光寿命τΜη。FRET发生率计算单元164计算出被后述的式(7)定义、且在活细胞中的供体分子中与受体分子结合、且发生FRET的供体分子的比例kfket。具体来说，FRET发生率计算单元 164利用受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命td、FRET发生时的供体分子的荧光寿命 τ V最短荧光寿命τΜη计算出kfket。更加具体地说，FRET发生率计算单元164根据后述的式(49)计算出κ FEETO另外，FRET效率E*、最大FRET效率& 、供体分子的荧光寿命、、FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ\、最短荧光寿命τΜη之间存在由后述的式(14)、式(18)所示的关系。因此，FRET发生率计算单元164适当地利用满足式(14)、式(18)的关系的相互等价的
物理量能够计算出kfket。观察矩阵计算单元166计算出被后述的式(31)定义的观察矩阵。具体来说，对仅体现供体分子的样品、仅体现受体分子的样品照射激光，利用所测量的荧光信号的结果，通过后述的式(40)至式(43)计算出观察矩阵。通过观察矩阵计算单元166计算出的观察矩阵通过校正透射供体波段的荧光信号以及透射受体波段的荧光信号，被用于求出供体分子发出的荧光信息、以及受体分子发出的荧光信息。第一分子浓度计算单元168利用供体分子发出的荧光信息，计算出作为活细胞的样品12中的供体分子的浓度。具体来说，第一分子浓度计算第一 168根据后述的式(15)计算出供体分子的浓度。第二分子浓度计算单元170利用受体分子发出的荧光信息，计算出作为活细胞的样品12中的受体分子的浓度。具体来说，第二分子浓度计算单元170根据后述的式(52)计算出受体分子的浓度。解离常数计算单元172计算出被后述的式(19)定义的、且作为供体分子和受体分子的结合强度相关的参数的解离常数Kd。具体来说，解离常数计算单元172利用FRET发生率计算单元164计算出的κ FKET、第一分子浓度计算单元168计算出的供体分子的浓度、第二分子浓度计算单元170计算出的受体分子的浓度，计算出解离常数Kd。更加具体地说，解离常数计算单元172根据后述的式(20)或者式(21)计算出解离常数Kd。〈FRET测量方法的概要〉下面，说明在FRET测量中所使用的各种常数。图6为表示FRET测量方法的一例的图。如图6所示，首先，在第一的预先测量中测量最大FRET效率Emax和最短荧光寿命τΜη。另外，在第二的预先测量中测量观察矩阵。 接着，在作为主测量的样品测量中测量作为在活细胞的测量样品中的供体分子中发生FRET 的供体分子的比例的kfket。接着，利用所测量的Kfket测量表示供体分子和受体分子的结合情况的解离常数Kd。首先，说明激光的输出和被该激光激发的荧光分子电子数的关系。如果将单位时间且单位体积激发的荧光分子的电子数设为NJlAi3S],则根据朗伯比尔定律(Lambert-Beer), N0 如下表示。[数1]N0 = JlA(1-10-EC1)/V (1)在此，JL[l/m2s]表示激光的单位面积、单位时间的能量(光子数)、A[m2]表示激光照射的面积，ε [1/Mm]表示荧光分子的摩尔吸光系数、C[M]表示荧光分子的浓度、1 [m]表示光路长度，V[m3]表示激光照射的物体的体积。荧光分子的浓度非常低时，式(1)可以接近于如下。[数2]N0 = InlO · Jl e C (2)另外，如果将激光波长表示为λ [m]、输出表示为P[W]，则下面的关系成立。[数3]JlA = P λ /hc (3)在此，h[J· s]为普朗克常数、c[m/s]为光速度。假设激光的截面形状为椭圆形、强度分布为二维高斯分布。此时，直径为Dc[m]的圆形的活细胞通过被激光照射而受到的平均功率Jex[l/m2s]由下述式表示。[数4]
权利要求
1.一种FRET测量方法，将激光照射在用第一分子和第二分子进行标记的测量样品上，并测量能量从第一分子朝向第二分子转移的FRET，其特征在于，该测量方法包括如下步骤最短荧光寿命计算步骤，对于第一分子浓度和第二分子浓度之比不同的多个预先测量样品，计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值；照射步骤，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；测量步骤，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；第一分子荧光寿命计算步骤，利用所述测量步骤中被测量的荧光信号计算出第一分子的荧光寿命；FRET发生率计算步骤，利用在所述最短荧光寿命计算步骤中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和计算出的所述第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生 FRET的第一分子的比例。
2.根据权利要求1所述的FRET测量方法，其特征在于，在所述FRET发生率计算步骤中，进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。
3.根据权利要求1或2所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括观察矩阵计算步骤，在该步骤中从所述测量步骤中测量的荧光信号，计算出用于求出通过在所述照射步骤中被激光照射而第一分子发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，所述观察矩阵计算步骤包括第一步骤，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分；第二步骤，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。
4.根据权利要求1至3任一项所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括解离常数计算步骤，在该步骤中利用所述FRET发生率计算步骤中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子结合情况的解离常数。
5.根据权利要求1至4任一项所述的FRET测量方法，其特征在于，在所述第一分子荧光寿命计算步骤中，利用在所述测量步骤中测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，计算出第一分子的荧光寿命。
6.根据权利要求3所述的FRET测量方法，其特征在于，在所述第一步骤中，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分；在所述第二步骤中，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分。
7.根据权利要求4所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括第一分子浓度计算步骤，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；第二分子浓度计算步骤，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子浓度；在所述解离常数计算步骤中，利用在所述第一分子浓度计算步骤中计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算步骤中计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。
8.—种FRET测量装置，将激光照射在用第一分子和第二分子标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子朝向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括激光光源部，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上； 测量部，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光； 荧光寿命计算部，利用所述测量部测量的荧光信号计算出第一分子荧光寿命； 最短荧光寿命计算部，利用第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品中的第一分子荧光寿命，计算出第一分子荧光寿命的最小值；FRET发生率计算部，利用在所述最短荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和在所述荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。
9.根据权利要求8所述的FRET测量装置，其特征在于，所述FRET发生率计算部是进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。
10.根据权利要求8或9所述的FRET测量装置，其特征在于，该装置包括观察矩阵计算部，从所述测量部中测量的荧光信号计算出用于求出所述测量样品被激光照射而第一分子发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，在所述观察矩阵计算部，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。
11.根据权利要求8至10任一项所述的FRET测量装置，其特征在于，包括解离常数计算部，在该部中利用在所述FRET发生率计算部中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子的结合状况的解离常数。
12.根据权利要求8至11所述的FRET测量装置，其特征在于，所述荧光寿命计算部利用在所述测量部测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。
13.根据权利要求10所述的FRET测量装置，其特征在于，在所述观察矩阵计算部， 利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分。
14.根据权利要求11所述的FRET测量装置，其特征在于，该装置包括第一分子浓度计算部，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度； 第二分子浓度计算部，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子的浓度； 所述解离常数计算部利用在所述第一分子浓度计算部计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算部计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。
全文摘要
本发明提供一种FRET测量方法及装置，能够求出在标记作为测量对象的活细胞的蛋白质的供体分子中与受体分子结合且发生FRET的供体分子的比例，其中，对于第一分子的浓度和第二分子的浓度比不同的多个预先测量样品，计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值；照射对强度进行了时间调制的激光，并测量出测量样品被激光照射而发出的荧光；利用所测量的荧光信号，计算出第一分子的荧光寿命；利用第一分子的荧光寿命的最小值和所计算出的第一分子的荧光寿命，计算出测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。
文档编号G01N21/64GK102597746SQ20108004265
公开日2012年7月18日 申请日期2010年9月13日 优先权日2009年9月29日
发明者中田成幸, 星岛一辉, 林弘能 申请人:三井造船株式会社