专利名称：一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光光谱快速同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹含量的方法，属于乳制品快速检测技术领域。
背景技术：
近年来，随着我国居民收入的提高和对乳制品消费观念的转变，食用乳制品的消费者人数逐年增加，我国的乳制品行业得到迅猛发展。然而从目前国内奶业的生产和加工状况来看，我国乳制品的质量与安全现状不容乐观。首先由于我国乳牛的农场化养殖水平较低，大部分原料乳(约占80%)是来自乳牛散养户，因此导致原料乳品质波动性很大。同时存在的乳中掺假、滥用抗生素等诸多问题也使得乳制品安全性存在重大隐患。·抗生素是由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年青霉素首次应用于临床起，抗生素的种类已达几千种。而临床上常用的约有几百种。抗生素在奶牛饲养业中被广泛使用医疗乳房炎等疾病。由于抗生素在常压下不受物理方法的破坏，因此如果对奶牛用药不当或滥用抗生素，牛乳中就会发生抗生素残留现象，并进一步转移到人体内。长期食用残留有抗生素的食品会引起人体的过敏、肝肾损伤等毒副作用。单诺沙星(DANO)是一种具有广谱抗菌活性的合成抗生素，它属于喹诺酮类药物的衍生物-氟喹诺酮类。氟甲喹(FLU)也是抗菌性的药物，属于喹诺酮类药物。它们的机理是作用是抑制细菌DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，从而阻止细菌的代谢繁殖。目前，这两种抗生素已经被广泛用于食用动物的治疗、防治疾病从而增加动物的产量，但是过量使用或使用不当会造成动物源性产品的药物残留，会对人体的中枢神经系统及关节等造成�：Γ佣鹑嗣枪惴汗刈�。随着奶牛饲养业的发展，喹诺酮类抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛应用，牛乳中抗生素的残留问题也随之而来，其不仅会对人的健康带来很大�：Γ叶匀橹破菲笠荡淳盟鹗В虼搜细窨刂婆Ｄ讨械目股夭辛袅渴呛苤匾囊徊健Ｅ访硕韵逝Ｈ橹兴闹粥低嗫股氐牟辛袅恳丫忻魅返墓娑ǎヅ瞪承�(30μ g/kg)、氟甲喹(50 μ g/kg)、恩诺沙星(100 μ g/kg)和麻保沙星(μ g/kg)等。目前，牛乳中抗生素残留量的检测方法主要有微生物检测法(TTC法、纸片法等)、理化检测法(HPLC法、LC-MASS法等)和免疫学分析法(ELISA法等)，但这些方法各自都有一定的缺点。微生物检测法的缺点是检测周期长，操作复杂等；理化检测法的缺点是前处理繁冗，耗时长等；免疫检测法则是对试剂选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度生物交叉反应等。在众多分析方法中，荧光光谱法因其快捷简便、高灵敏度等优点而成为很好的选择，国外也已有学者利用此方法对牛乳中单组分抗生素(DANO)残留量进行检测分析，但并没有对牛乳中DANO和FLU两种抗生素的同时检测的报道，所以本发明采用荧光光谱法实现对牛乳中的DANO和FLU进行同时检测。对于本发明所研究的两种抗生素而言，因其具有荧光基团，在吸收光后能放射出荧光，所以使得荧光光谱法检测喹诺酮抗生素成为可能。单诺沙星(DANO)与氟甲喹(FLU)都属于喹诺酮类药物，单诺沙星在激发波长(λΘΧ)/发射波长(Xem)为280/440nm时出现最高荧光峰；氟甲喹的荧光出峰位置则在激发波长/发射波长为320/360nm。但是由于牛奶体系较为复杂，含有许多具有荧光性的物质，如蛋白质(λΘΧ/λ_=290/320ηπι)、维生素 A ( λ ex/ λ em=321/410nm)、美拉德产物(λ ex/ λ em=360/410nm)和核黄素(λ ex/λ em=360/410nm)等化合物，这些荧光物质会与所研究的抗生素的荧光信号发生光谱重叠，尤其是荧光强度高的蛋白质对分析物的荧光信号影响特别严重，所以去除蛋白是本文中必要的一步。再应用化学计量学的方法对荧光光谱图进行处理解析之后，就可排除其它荧光组分的干扰(美拉德产物等)，建立最佳校正模型和快速检测方法。本文中共采用了两种计量学方法偏最小二乘法回归(PLS2)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。偏最小二乘法主要是用于定量分析，对未知样品中的某种组分含量进行预测，它在分解光谱矩阵时同时考虑了浓度矩阵的影响。偏最小二乘判别分析法主要是用于定性分析，判别单个未知样品与已知样品组之间的关系。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种利用荧光光谱并结合化学计量学的方法，建立快速且同时检测牛乳中单诺沙星和氟甲喹残留量的方法。一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，包括以下步骤(I)校正集样本的收集在不含单诺沙星与氟甲喹的牛奶样本中加入不同量的单诺沙星与氟甲喹，使牛奶体系中单诺沙星的浓度在0-56 μ g L-1范围内，氟甲喹的浓度在0-100 μ g Γ1范围内，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质，收集澄清的校正集样本；(2)校正集样本荧光光谱的测定使用荧光分光光度计扫描样本，获取荧光光谱数据；(3)校正模型的建立利用多元校正化学计量学方法，分别构建校正集样本中单诺沙星与氟甲喹含量与荧光光谱数据之间关系的数学模型，用于样本单诺沙星与氟甲喹含量的预测并判断出阴性与阳性样品； (4)校正模型的验证取已知单诺沙星与氟甲喹含量的牛奶验证集样本，在与步骤(2)中相同条件下扫描获取荧光光谱数据，根据已建立的校正模型计算样本中单诺沙星与氟甲喹含量以及对阴性与阳性样本进行分类；(5)校正模型的应用采集待测样本的荧光光谱数据，获取特征光谱信息，将该光谱信息输入已建立的校正模型中，筛选出阴性样本并计算出牛奶样本中单诺沙星与氟甲喹的含量。所述的步骤(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质的方法为加入浓度为50% (w/V)的三氯乙酸，至蛋白质沉淀，静置5min,离心,过滤。所述的步骤(2)中荧光光谱数据的采集条件为以320nm为激发波长，以330-530nm为发射波长范围，以5nm为激发波长和发射波长的狭缝宽度，以1200nm/min为进行光谱扫描速度，每个样本作3次平行扫描，取平均扫描数据作为样本的荧光光谱数据。所述的多元校正化学计量学方法为偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS),使用的计算机软件为Unscrambler软件。所述的阴性牛奶样本为牛奶体系中单诺沙星含量小于最大残留量30 μ gL—1、氟甲喹含量小于最大残留量50 μ g L—1的样本；所述的阳性样本为牛奶体系中单诺沙星含量大于最大残留量30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大残留量50 μ gL—1的样本。本发明的有益效果采用PLSDA分析可以得到很好的结果，它可以同时且正确地将抗生素含量在最大残留量上下的样本分类。而采用PLS回归分析可以对未知样本中抗生素的含量进行预测，且两个抗生素的平均回收率为101%和97%。采用本发明的荧光法并结合化学计量学是可以快速且同时检测出牛奶中单诺沙星与氟甲喹抗生素。本发明方法简单快速、准确性高、灵敏度高，可以有效解决牛奶的质量监控问题，使乳品安全得到保障。
图I为校正集样本的荧光光谱图；图2为PLS回归模型中的主成分载荷图；图3为FLU含量PLS回归模型的真实值与预测值间的相关关系； 图4为DANO含量PLS回归模型的真实值与预测值间的相关关系。
具体实施例方式一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，包括以下步骤(I)校正集样本的收集在不含单诺沙星与氟甲喹的牛奶样本中加入不同量的单诺沙星与氟甲喹，使牛奶体系中单诺沙星的浓度在0-56 μ g L-1范围内，氟甲喹的浓度在0-100 μ g Γ1范围内，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质，收集澄清的校正集样本；(2)校正集样本荧光光谱的测定使用荧光分光光度计扫描样本，获取荧光光谱数据；(3)校正模型的建立利用多元校正化学计量学方法，分别构建校正集样本中单诺沙星与氟甲喹含量与荧光光谱数据之间关系的数学模型，用于样本单诺沙星与氟甲喹含量的预测并判断出阴性与阳性样品；(4)校正模型的验证取已知单诺沙星与氟甲喹含量的牛奶验证集样本，在与步骤
(2)中相同条件下扫描获取荧光光谱数据，根据已建立的校正模型计算样本中单诺沙星与氟甲喹含量以及对阴性与阳性样本进行分类；(5)校正模型的应用采集待测样本的荧光光谱数据，获取特征光谱信息，将该光谱信息输入已建立的校正模型中，筛选出阴性样本并计算出牛奶样本中单诺沙星与氟甲喹的含量。所述的步骤(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质的方法为加入浓度为50% (w/V)的三氯乙酸，至蛋白质沉淀，静置5min,离心,过滤。所述的步骤(2)中荧光光谱数据的采集条件为以320nm为激发波长，以330-530nm为发射波长范围，以5nm为激发波长和发射波长的狭缝宽度，以1200nm/min为进行光谱扫描速度，每个样本作3次平行扫描，取平均扫描数据作为样本的荧光光谱数据。所述的多元校正化学计量学方法为偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS),使用的计算机软件为Unscrambler软件。所述的阴性牛奶样本为牛奶体系中单诺沙星含量小于最大残留量30μ gL—1、氟甲喹含量小于最大残留量50 μ g L—1的样本；所述的阳性样本为牛奶体系中单诺沙星含量大于最大残留量30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大残留量50 μ gL—1的样本。下面结合实施例，进一步阐述本发明I.校正集样本的收集(I)试剂、溶液的配制DANO, FLU工作液的配制取DANO标准品O. Olg,先用甲醇溶液(色谱纯)进行溶解，再用超纯水定容至100ml，获得IOOmg Γ1的DANO储备液，装置于棕色试剂瓶中，储存于4°C。将得到的IOOmg Γ1的DANO储备液稀释至Img L—1，从而得到DANO工作液。取FLU标准品O. Olg,先用甲醇溶液(色谱纯)进行溶解,再用超纯水定容至100ml,获得IOOmg Γ1的FLU储备液，装置于棕色试剂瓶中，储存于4°C。将得到的IOOmg Γ1的FLU储备液稀释至Img L—1，从而得到FLU工作液。 三氯乙酸试剂的配制取三氯乙酸250g，再加入500ml的去离子水，获得50% (w/V)浓度的三氯乙酸试剂。(2)校正集样本的配制以具有代表性的某品牌超高温灭菌的全脂阴性牛奶样品作为校正样本，采用加标法，在50ml容量瓶中加入5ml牛奶，再加入适量的DANO和FLU工作液(lmg/L)，用超纯水定容，使牛奶体系中 DANO 的浓度在 0-56 μ g I/1 之间(0，16，24，32，40，48，56 μ g I/1 )，FLU 的浓度在O-IOOyg L—1范围内(0，25，40，55，70，85，100 μ g L—1)。其中，两个分析物的浓度分别两两混合。每个样品移取5ml至IOml离心管中，然后再加入lml50% (w/v)浓度的三氯乙酸，振荡混勻，静置5min后；离心，4000rpm, IOmin,过滤,收集上清液,得校正集样品。2.校正样本中单诺沙星与氟甲喹的含量单诺沙星的浓度为:0，16，24，32，40，48，56μ g Γ1 ;氟甲喹的浓度为=0,25,40,55,70,85,100 μ g L—1。3.校正集样本光谱数据的采集以320nm为激发波长，以330_530nm为发射波长范围，以5nm为激发波长和发射波长的狭缝宽度，最后以1200nm/min进行突光光谱扫描。4.校正集样本的选择使用计算机定制软件(Unscrambler等)残差分布图的方法对样本进行选择,将残差值较大的数据暂定为异常样本，以相关系数和交叉验证误差均方根RMSECV作为校正模型性能优劣判定依据，剔除影响模型性能的异常样本，最后确定校正集样本数，校正模型及验证模型的评价参数(I)相关系数R2:
nZ _ Λ Si=i{Fi,,actual ~ 3^ ,predicted)■ — I — yn fZi V-
^I=IW i.-actual /!..actual/
5Yi, actual为第i样品参考方法的测定值，FiiartaaI为校正集所有样品参考方法测定值的平均值，Yipredirted为校正集预测过程中第i样品的预测值，η为校正集的样品数。R2值越接近1，表示校正模型的预测值与真实值越接近，(2)交叉验证均方根误差RMSECV
权利要求
1.一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)校正集样本的收集在不含单诺沙星与氟甲喹的牛奶样本中加入不同量的单诺沙星与氟甲喹，使牛奶体系中单诺沙星的浓度在0-5648 171范围内，氟甲喹的浓度在0-100 μ g Γ1范围内，加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质，收集澄清的校正集样本。
(2)校正集样本荧光光谱的测定使用荧光分光光度计扫描样本，获取荧光光谱数据。
(3)校正模型的建立利用多元校正化学计量学方法，分别构建校正集样本中单诺沙星与氟甲喹含量与荧光光谱数据之间关系的数学模型，用于样本单诺沙星与氟甲喹含量的预测并判断出阴性与阳性样品。
(4)校正模型的验证取已知单诺沙星与氟甲喹含量的牛奶验证集样本，在与步骤(2)中相同条件下扫描获取荧光光谱数据，根据已建立的校正模型计算样本中单诺沙星与氟甲喹含量以及对阴性与阳性样本进行分类。
(5)校正模型的应用采集待测样本的荧光光谱数据，获取特征光谱信息，将该光谱信息输入已建立的校正模型中，筛选出阴性样本并计算出牛奶样本中单诺沙星与氟甲喹的含量。
2.根据权利要求I所述的一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，所述的步骤(I)中加入三氯乙酸除去牛奶中蛋白质的方法为加入浓度为50% (w/v)的三氯乙酸，至蛋白质沉淀，静置5min,离心,过滤。
3.根据权利要求I所述的一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，所述的步骤(2)中荧光光谱数据的采集条件为以320nm为激发波长，以330_530nm为发射波长范围，以5nm为激发波长和发射波长的狭缝宽度，以1200nm/min为进行光谱扫描速度，每个样本作3次平行扫描，取平均扫描数据作为样本的荧光光谱数据。
4.根据权利要求I所述的一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，所述的多元校正化学计量学方法为偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘法(PLS)，使用的计算机软件为Unscrambler软件。
5.根据权利要求I所述的一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法，所述的阴性牛奶样本为牛奶体系中单诺沙星含量小于最大残留量30 yg L—1、氟甲喹含量小于最大残留量50 μ g L—1的样本；所述的阳性样本为牛奶体系中单诺沙星含量大于最大残留量.30 μ g L_\氟甲喹含量大于最大残留量50 μ g L—1的样本。
全文摘要
本发明涉及一种同时测定牛奶中单诺沙星与氟甲喹的荧光方法。首先收集具有代表性的已加入单诺沙星和氟甲喹的牛奶样本作为校正集，选择合适的荧光扫描条件，扫描得到校正样本集的荧光光谱图，其次以两种抗生素各自的浓度作为参照值，应用化学计量学技术，同时构建牛奶中单诺沙星和氟甲喹荧光光谱信息与其各自的浓度变量之间关系的多元校正模型，最后对未知单诺沙星和氟甲喹抗生素含量的牛奶样本进行荧光光谱扫描和得到特征光谱信息，利用已建立的定性和定量校正模型分别判断和计算两种抗生素的含量。本发明方法简单快速、准确性高、灵敏度高，可以有效解决牛奶的质量监控问题，使乳品安全得到保障。
文档编号G01N21/64GK102879368SQ20121036358
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者刘小鸣, 陈卫, 冯仕云, 周鹏, 范大明 申请人:江南大学
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