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专利名称：免疫测定标准物以及利用内部测定校准标准物测量临床生物标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的组合物，能够在免疫测定中用作参照标准物和校准物以测量临床生物标志物。本发明还涉及使用所述组合物的方法和包含所述组合物的试剂盒。
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背景技术：
淀粉样蛋白β (Αβ)肽是由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)通过β分泌酶和Y分泌酶酶复合物被剪切而生成的(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。β分泌酶生成这些淀粉样蛋白肽的N末端,而Y分泌酶生成C末端(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。后来人们制成了数种肽，长度典型地为38-42个氨基酸不等，取决于、分泌酶在哪里切割ΑΡΡ。Αβ肽具有一个胞外域(氨基酸1-28)和一个包埋在脂双层膜内的跨膜域(氨基酸29-42)。长度为42个氨基酸的淀粉样蛋白肽(Αβ42)被认为是假定的神经毒性种类，或是单独地，或是作为聚集体。人们怀疑这些聚集体对脑的神经变性起贡献，结果导致阿尔茨海默病和痴呆。A β 42对临床痴呆起贡献的假说称为淀粉样蛋白级联假说，如Hardy等人所述(Science, 256:184-185 (1992))。Αβ肽的特征之一是在生理浓度下自组装成为寡聚体的能力(Burdick etal. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554(1992) ;Cerf et al. , BiochemicalJournal, 421:415-423 (2009).)。Αβ 42种类较之Αβ 4(l和Αβ 38种类更易于形成寡聚体。已经证明寡聚体形成的机制是起源于位于氨基酸16-20处的一个小的五氨基酸区域(KLVFF)，其介导Αβ肽们以反平行的方式结合。这个小区域因此得名“聚集域”(Tjernberg etal. , Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))。在特定的条件下,尤其是在低PH范围，Αβ肽聚集体的组装很迅速(即在数分钟之内)，而在中性或更高的pH动力学则较之为慢(Burdick et al. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992))。聚集体在水性条件下，尤其是在盐存在下不易溶。Αβ肽的C末端藉由盐桥折叠翻过二聚体的中心，从而增加它们的疏水性并促进肽们进一步聚合形成纤丝或原纤维。Αβ42种类中额外的两个C末端残基提供较之其他的A β种类增加的疏水性(Kim et al. , Journal ofBiological Chemistry, 280:35069-35076 (2005))。临床数据提示，痴呆和认知减退与Aβ 42浓度的相关性比与Αβ 4(|或Αβ 38种类更高。该结果与Αβ42的快速聚集性质一起已经导致人们提出抑制Αβ42具体可具有临床效益的假说。已经有多项研究显示可以利用不同的机制来抑制々042聚集体的形成。Tjernberg et al. (Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))显不，包含聚集域的肽可很好地与Αβ肽结合，并抑制聚集体的形成。还有人显示其他的几种结合聚集域的分子也可抑制淀粉样蛋白肽聚集(Martharu et al. , Journal of NeurologicalSciences, 280:49-58(2009);Kim et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications, 303:576-279 (2003))。对聚集核心域中的氨基酸进行替代或删除整个聚集域也可防止 Αβ 聚集和原纤维形成(Tjernberg et al. , Journal of Biological Chemistry, 274:12619-12625(1999))。此外，人们已设计了多种药物来抑制Y分泌酶活性，以降低Αβ 42和相关肽种类的量。这些手段在临床上的效用目前还在研究之中。为了评估分子抑制六@42生成或防止其聚集的有效性，准确地测量Αβ42的量是必要的。有几种技术被用来对生物样品中的々042进行检测和定量，包括免疫测定(Olsson et al. , Clinical Chemistry, 51:336-345(2005);Verwey etal. , Journal of Immunological Methods, 348:57-66(2009);Sjogren et al. , Journalof Neural Transmission, 107:563-679 (2000))和基于质谱(MS)的方法(Cantoneet al., Journal of Neuroscience Methods, 180:255-260(2009);Journal of MassSpectrometry, 40:142-145 (2005))。基于质谱的方法，包括 MALDI-T0F 和 SELDI-T0F 以及液相色谱制备质谱(liquid chromatography prepared mass spectrometry)方法，能够检测生物样品中许多淀粉样蛋白β种类，但目前尚不能提供测量临床样品中的Αβ42所需的足够定量数值。免疫测定方法是基于一种双夹心免疫测定法，其包含一种对A β 42Ν末端特异性的抗体，和另一种对AP42C末端高度特异(即不识别其他Αβ肽种类)的抗体。免疫测定有两种基本形式。第一种形式藉由固定在固体表面的N末端区域特异性抗体捕捉生物样品中 的Αβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的八042特异性抗体以完成抗体夹心。第二种形式藉由固定在固体表面的C末端区域特异性抗体捕捉生物样品中的Αβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的N末端区域特异性抗体。在任何一种形式中，通过第二种抗体导入的标签容许对完整的复合物加以检测。通过使用Αβ42参照标准物(添加标准物代替生物样品)来使得这些测定定量化。用从参照标准物测量得到的信号产生标准曲线，然后用标准曲线来定量所述生物样品中Αβ42的量。迄今为止，在免疫测定中使用A β 42参照标准物都是依赖合成的全长A β 42肽，通常产生它们的难度很小。但是，这些肽具有很强的疏水性质，因此在水性溶液中不可溶。此外，Αβ 42作为参照标准物的贮存和使用都存在不少问题。如已经讨论的，Αβ 42迅速地形成聚集体，而且这种形成在室温和中性PH条件下更容易发生。在低温(-20’ C)和低pH下长期储存有助于最大程度地减小储存中的聚集，但不能防止之。在适于免疫测定的缓冲液中重溶A β 42也可能造成困难。这些溶剂几乎总是水性的，缓冲于中性pH，含有盐，并且在室温下使用。这些条件都是加速A042聚集的。由于不溶性沉淀物，以及在大小和可被检测抗体和捕捉抗体识别的性质上的不均一性，已经聚集的々042肽是无法用作免疫测定中的参照标准物的。因此，本发明通过提供可用于生成^42肽或其蛋白质构建物和组合物的方法，所述Αβ 42肽或其蛋白质构建物和组合物可以用作免疫测定或其他模式中的参照标准物或校准物来准确地测定液体或组织提取物样品中A β 42肽的丰度，从而满足了本领域的需求。具体地说，本发明的组合物和方法旨在产生用于Αβ42的非聚集性的肽参照标准物，供免疫测定模式中使用。本文中描述的组合物可方法可以广泛地应用于其他许多难于测定和定量的肽。

发明内容
在一个方面中，本发明提供一种组合物，其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域、以及接头区域。在另一个方面中，本发明提供一种组合物，其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域、以及接头区域，其中所述组合物在免疫测定中用作参照标准物。在一个实施方案中，所述免疫测定选自下组夹心免疫测定、单一抗体测定、双夹心免疫测定、和竞争测定。在另一个实施方案中，所述组合物选自下组蛋白质、肽、片段和修饰的蛋白质。在一个实施方案中，所述N-末端免疫反应性区域结合A β 42、A β 4(|、A β 38、tau或胰岛素生长因子受体I。在另一个实施方案中，所述C-末端免疫反应性区域结合八042404(|40383&11或胰岛素生长因子受体1。在另一个实施方案中，所述接头区域是非免疫反应性区域。在另一个实施方案中，所述接头区域包含选自下组的接头聚乙二醇、谷氨酰胺残基、丙氨酸残基、赖氨酸残基、脂质、球状蛋白质、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、以及烷基链。在另一个方面中，本发明提供具有SEQ ID NO: 1，2，3，4，5，6，7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26或27的氨基酸序列的分离的肽分子。在另一个方面，本发明提供一种用于测量生物样品中被分析物的量的方法，该方法包括将参照标准物附接到至少两个珠子上，从而形成第一珠子组和第二珠子组，其中所述参照标准物包含被第一检测抗体识别的表位，且其中每个珠子组包含不同浓度的所述参 照标准物；将对所述被分析物特异的捕捉抗体附接到第三珠子组上；将全部所述珠子组混合到一起形成悬浮阵列(suspension array);将生物样品施加于该悬浮阵列，以致所述被分析物结合于所述第三珠子组上的捕捉抗体；添加第一检测抗体到该悬浮阵列，其中所述第一检测抗体结合参照标准物和结合于该捕捉抗体的被分析物；测量来自所述第一珠子组中结合于参照标准物的第一检测抗体的第一信号；测量来自所述第二珠子组中结合于参照标准物的第一检测抗体的第二信号，基于所述第一和第二信号产生标准曲线；并通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较而确定该第三珠子组中被分析物的量。在一个实施方案中，所述参照标准物包含组合物，所述组合物包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域和接头区域。在另一个实施方案中，所述参照标准物包含具有SEQ ID NO: I, 2，3，4，5，6，7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26或27的氨基酸序列的肽或修饰肽。在另一个实施方案中，所述生物样品选自血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞、组织、脑脊液和细胞。在另一个实施方案中，被分析物选自
A β 42. A β 40. A β 38. tau或胰岛素生长因子受体IO在另一个实施方案中，所述方法在多孔板、硝酸纤维素滤材、玻璃纤维中，或者在玻片上进行。在另一个实施方案中，所述第一信号和第二信号是选自藻红蛋白、alexa 532、链亲和素-藻红蛋白、和链亲和素-Alexa 532的信号。在另一个实施方案中，所述参照标准物共价附接于所述珠子。在另一个实施方案中，所述捕捉抗体共价附接于所述珠子。在另一个实施方案中，所述共价附接是碳二亚胺键。在另一个方面，本发明人提供了用于实施免疫测定来检测A β42肽的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的组合物。表格简要说明表格I显示了 Αβ肽的理想的物理性质，以及用于测量这些性质的测试。表格显示了 A β 42肽和修饰的肽序列以及说明。
表格3显示了 tau肽和修饰的肽序列以及说明。表格4在3份人脑脊液(CSF)样品中测得的Aβ 42肽的浓度。表格5是经过表征的新A β肽的列表。表6显不动态光散射(DLS)数据的汇总。附图简要说明图I显示双侧(two-sided)或夹心式可溶性标准物的示意图。图2显示来自示例性A β42夹心免疫测定的校准曲线。 图3显示使用修饰的A β 42肽标准物的示例性A β 42夹心测定。图3Α显示来自修饰的标准物2 (SEQ ID NO:2)和4(SEQ ID NO:4)的校准曲线。图3B显示来自修饰的标准物12 (SEQ ID NO: 12)和13 (SEQ ID NO: 13)的校准曲线。图3C显示来自修饰的标准物14 (SEQ ID NO: 14)和6 (SEQ ID NO:6)的校准曲线。图4显示Αβ42内部测定珠子方法的示意图。图5Α显示共价偶联有不同浓度的Αβ 1-40肽(SEQ ID Ν0:15)的6个不同的Luminex珠子组测得的中值荧光强度(MFI)。图5Β显示来自A β 4。内部测定标准物(圆)或来自作为可溶性标准物的天然A β 42肽的4-PL生成的校准曲线，与图2中所示的曲线相似。图5C显示利用从可溶型Αβ 42肽产生的校准曲线或从内部测定Αβ 4(|标准物生成的标准曲线在人CSF样品中测得的A β 42肽。图6显示人外周血单核细胞裂解物中磷酸化的胰岛素生长因子受体I (IGF-Rl)的水平。从不同珠子组上的MFI值生成了 4参数校准曲线(图6Α)，并用该曲线来确定PBMC裂解物中磷酸化IGF-Rl的相对水平(图6Β)。图7显示DLS数据。图8显示圆二色分析。图9显示肽稳定性数据。对于全长Αβ 42和7种修饰肽在不同温度下进行稳定性研究，长达40天(图9A-9F)。

图10显示全长^42与7种修饰肽之间的标准曲线比较。图11显示全长肽相对修饰肽的标准曲线分析。图12显示使用全长肽相对使用修饰肽的CSF样品分析。图13显示掺入修饰A β (1_42)肽的聚乙二醇间隔物的结构。发明详述通过参考下面对本发明的优选实施方式的详细说明以及包括在本文内的实施例，可以更容易地理解本发明。本发明涉及新的组合物和方法，可以用来作为参照标准物和校准物，以在免疫测定中测量临床生物标志物。本发明还涉及使用所述组合物的方法和包含所述组合物的试剂盒。具体地，本发明的组合物和方法旨在产生非聚集性的用于Ai342*tau的肽参照标准物，以供免疫测定模式中使用。本发明还涉及包含本发明的组合物的试剂盒。定义
如本文使用的，术语“Α β ”是指淀粉样蛋白β。如本文使用的，术语“Αβ42”是指淀粉样蛋白β1-42。“Αβ42”是指一种42个氨基酸长的肽，其具有如表2，SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列。如本文使用的，术语“Αβ 38”是指淀粉样蛋白β 1-38。“Αβ 38”是指一种38个氨基酸长的肽,其具有序列 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG(SEQ ID NO: 17)。如本文使用的，术语“Αβ4(ι”是指指淀粉样蛋白β1-40。“Αβ4(ι”指一种40个氨基酸长的肽，其具有如表2，SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。如本文使用的，术语“tau”是指与表3，SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列对应的天然tau蛋白。如本文使用的，术语“抗体”以其最广泛的意义使用，具体涵盖单克隆抗体(包括 全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(即双特异性抗体)、以及抗体片段(及Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它们展现针对选定抗原的结合活性或亲和力。“抗体”还可以指附着于(hang to)或融合于载体蛋白/生物，例如噬菌体或其他展示载体、具有与分离的抗体相同的性质的抗体或抗体片段。如本文使用的，术语“分离的”，在指主题蛋白和蛋白复合物时，指蛋白或蛋白复合物的制备物基本不含通常会与该蛋白或复合物一起存在(例如该蛋白或复合物内源存在的细胞环境中)的污染蛋白。因此，分离的蛋白复合物与那些通常会“污染”或干扰对分离条件下该复合物的研究(例如当筛选其调节物时)的细胞组分是分离的。然而需要理解的是，这样的“分离”的复合物可以包含这样的其他蛋白质，所述主题蛋白或蛋白复合物对该蛋白质的调节作用是考察的对象。如本文使用的，术语“分离的”在本文中还对核酸如DNA或RNA使用，指以不出现于自然界中的状态存在的分子。此外，“分离的核酸分子”意图包括不会天然作为片段出现，也不会在自然状态下被发现的核酸片段。如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)，此外在合适时还可指核糖核酸(RNA)。该术语还可以理解为包括(作为等价物)从核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物，以及单链(如有义或反义)和双链多核苷酸，这一点适用于现在描述的实施方案。“核酸”还可以指肽核酸“PNA”或人工合成的DNA或RNA。如本文使用的，术语“肽”、“蛋白(质)”和“多肽”在本文中可以互换使用。术语“纯化的蛋白质”指这样的蛋白质制备物，其优选地与细胞或细胞裂解物中通常伴随于该蛋白质的其他蛋白质分离，抑或实质上不包含这样的其他蛋白质。如本文使用的，术语“修饰肽”指相对于该肽的天然序列已经被修饰的肽。例如，修饰可以包括在天然肽序列中去除有害的域或者添加接头。如本文使用的，术语“结合”是指两个分子之间由于，例如，共价、静电、疏水、离子、和/或氢键相互作用等在生理条件下直接缔合。类似的，两个或更多个多肽之间的“复合物形成”是指多个多肽之间由于例如共价、静电、疏水、离子、和/或氢键相互作用等在生理条件下直接缔合。如本文使用的，术语“域”是指蛋白质中包含特定结构和/或行使特定功能的区域(即，聚集域，“磷酸化域”)。术语“聚集域”如本文中所用的，是指位于氨基酸16-20 (KLVFF(SEQ ID NO: 18))的介导Αβ肽以反向平行的方式结合的五氨基酸区域。
如本文使用的，术语“免疫反应性域”是指蛋白质中包含能被抗体识别的特定氨基酸序列的区域。该区域包括含有修饰的氨基酸序列，所述修饰例如糖基化、甲基化、磷酸化、或任何本领域技术人员知道的其他翻译后修饰。可以被磷酸化的氨基酸的实例有酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸氨基酸。包含磷酸化氨基酸的“免疫反应性域”也可以表述为磷酸化域。“免疫反应性”域还可以包含蛋白质的两个或更多个如下所述的区域，这些区域在蛋白质的天然折叠状态下相互接近，共同构成抗体结合位点。如本文使用的，术语“免疫测定”在本文中用来指这样的生化测试，其利用一种或多种抗体来测量生物学基质中被分析物的存在或浓度。这种测定可响应于抗体对特定蛋白或肽的免疫反应性域的特异性结合而产生可测量的信号。参照标准物在一个方面，本发明涉及能够用作参照标准物和校准物来测量临床生物标志物的 组合物。在一个实施方案中，所述参照标准物包含肽。所述肽可以是修饰肽。所述修饰肽可以在非免疫反应性域中包含接头、删除或替代。在另一个实施方案中，所述非免疫反应性域是聚集域或磷酸化域。聚集或非免疫反应性域中的改变在一个方面，本发明提供可以用作参照标准物的修饰肽。有已知的域或氨基酸序列可导致粘性(sticky)肽如A β42与自身或其他分子发生自身聚集和非特异性相互作用。这样，有可能构建缺少这些有害域的标准物或校准物。本发明提供数种修饰肽来去除有害域的方式。在一个实施方案中，构成有害域的氨基酸从氨基酸序列中被删除，而N-末端免疫反应性域与C-末端免疫反应性域连接，缺少中央的17-20氨基酸序列以及不同长度的邻近C-末端肽(在A β 42的情况下)。中央肽被删除的A β 42肽的例子在表2，SEQ ID NO: 2、3和4中显示。在一个实施方案中，中央聚集域加上邻近的氨基酸被替换为由多种不同物质构成的接头或者间隔物。在另一个实施方案中，考虑以不聚集的氨基酸作为接头。在一个实施方案中，不聚集的氨基酸呈及氨基酸序列的亲水性间隔物或接头的形式，或者是EERP的形式，后者与八运42的(末端37-42序列(SEQ ID NO: 5)及A β 42的C末端32-42部分(SEQ ID NO: 6) 一起显示。在另一个实施方案中，Aβ42肽包含更长的亲水性接头，例如氨基酸序列DREPNR (SEQID NO: 16)，其带有 A β42 的 C 末端 37-42 (SEQ ID NO: 7)和 C 末端 32-42 (SEQ ID NO: 8)部分。在还有一个实施方案中，使用一系列带电残基，以N-末端和C-末端免疫反应性域之间的接头的形式使用。在另一个实施方案中，创建由整数m个赖氨酸残基(SEQ ID NO:9)或整数η个谷氨酸残基(SEQ ID NO: 10)构成的接头。在另一个实施方案中，使用一串中性残基作为接头。在另一个实施方案中，考虑由整数P个丙氨酸残基(SEQ ID NO: 11)构成的构建体。在本发明的另一个实施方案中，使用不同形式的聚乙二醇(PEG)作为接头。在优选的实施方案中，将PEG-6原子和PEG-20原子与不同的C-末端部分一起使用(SEQ IDNO: 12-14)。在另一个实施方案中，使用任何具有能够偶联于氨基酸残基的化学的聚合物作为接头或间隔物。这种聚合物包括那些直链形式的聚合物和那些具有已知的分枝拓扑学的聚合物，如树突聚物(dendrimers)和分枝共聚物，以刺激A β 42或其他类似的粘性或自聚集性分子等寡聚物的免疫反应性。还可以利用tau的磷酸化区域来产生可用作参照标准物的修饰肽。异常高磷酸化的tau与神经纤维缠结有关。Tau有多个磷酸化位点；每个位点对其生物学功能有不同的影响。对磷酸化的tau在Ser202/Thrl81/Thr212/Thr231或Ser262处的测量可以帮助了解哪个与MCI受试者中的认知衰退相关。因此，在另一个实施方案中，考虑用修饰的tau肽作为参照标准物。修饰的tau肽的例子示于表3。在另一个实施方案中，接头可包含下述分子中的任一种脂质、球状蛋白质、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、烷基链、或任何其他增加免疫测定中感兴趣的两个免疫表位的稳定性的联接。在另一个实施方案中，肽骨架和接头之间的键包括共价键、亲和素-生物素复合物或任何其他稳定的键。在另一个实施方案中，构建体不导致自聚集或对实验室塑料制品的非特异性吸附，所述实验室塑料制品尤其是聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbon)、或其他用于制备实验室塑料，移液器吸头、试管、平板、以及其他容纳可以在 其中对感兴趣的被分析物进行测量的液体的容器的实验室塑料树脂。在另一个实施方案中，新Αβ 42或tau免疫测定标准物或校准物需要被N-末端特异性抗体识别的N-末端表位的存在。本领域已知有很多种Αβ 42N-末端结合抗体。例如，6E010已知识别Aβ 3_8表位,而3D6已知识别Αβ的N-末端表位。可设计重叠表位以容许根据免疫测定要求和检测系统选择数种要使用的N-末端特异性抗体。在另一个实施方案中，新Αβ42免疫测定标准物或校准物需要需要被C-末端Αβ 42特异性抗体识别的C-末端表位的存在。有充分表征的C-末端Αβ 42新表位抗体包括 G2-11 (来自 Heidelberg 大学)、21F12 (来自 Athena Diagnostics)、4D7A3 (来自Innogenetics)、和12F4(来自Covance,原Signet)。可设计重叠C-末端表位以容许根据免疫测定要求和检测系统选择数种要使用的C-末端Αβ 42特异性抗体。在另一个实施方案中，在此可使用本领域技术人员已知的任何N-末端结合性、C-末端结合性或磷酸化tau结合性抗体。本发明还涉及用于生成肽或蛋白构建体及其组合物的方法，所述构建体或其组合物可以用作免疫测定中的参照标准物或校准物来准确地测量液体或组织提取物样品中的肽的丰度。免疫测定往往需要生物学上特异性的捕捉试剂，如抗体，来捕捉感兴趣的被分析物或生物标志物。可以通过本领域公知的方法，即通过用生物标志物作为抗原免疫动物，来产生抗体。可以基于生物标志物的结合特征来从样品分离它们。或者，如果多肽生物标志物的氨基酸序列是已知的，可以合成该多肽并使用它们通过本领域已知的方法来生成抗体。生物标志物的例子包括A β肽和tau。本发明考虑传统的免疫测定，包括例如夹心免疫测定，包括ELISA或基于荧光的免疫测定，以及其他酶免疫测定。在基于SELDI的免疫测定中，将针对生物标志物的生物特异性捕捉试剂附接在质谱(MS)探针，如预活化的PRQ j丨」]NC IiiP R阵列的表面上。然后通过该试剂特异性地将该生物标志物捕获在生物芯片上，并通过质谱检测被捕获的生物标志物。因此，在一个方面，本发明涉及用本发明的参照标准物来测量临床标志物的方法。在一个实施方案中，参照标准物是通过免疫测定测量的。在另一个实施方案中，免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中，免疫测定是单一抗体免疫测定，经常以对免疫反应性结合位点的竞争性或“竞争”模式运行。在另一个实施方案中，免疫测定是双重夹心免疫测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一个优选的实施方案中，测量临床标志物的方法是通过使用免疫测定，所述免疫测定包含下述步骤将参照标准物附接到至少两个珠子上，从而形成第一珠子组和第二珠子组，其中所述参照标准物包含被第一检测抗体识别的表位，且其中每个珠子组包含不同浓度的所述参照标准物；将对被分析物特异性的捕捉抗体附接到第三珠子组；将所有珠子组混合到一起而形成悬浮陈列；将生物样品施加到该悬浮阵列，以使得被分析物结合到所述第三珠子组上的捕捉抗体；向该悬浮阵列加入第一检测抗体，其中所述第一检测抗体结合参照标准物结合于和所述捕捉抗体的被分析物；测量来自结合于所述第一珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第一信号；测量来自结合于所述第二珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第二信号；基于所述第一和第二信号产生标准曲线；并通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较而确定该第三珠子组中被分析物的量。不对本发明构成限制，应当理解珠子组可以替换为任何其中通过特定检测技术或仪器可独立测量多重信息的其他固相。 在一个实施方案中，所述参照标准物包含本文中描述的组合物。在另一个实施方案中，所述生物样品选自血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞组织、脑脊液和细胞。在另一个实施方案中，所述被分析物是々042、4 04(|、4 038、tau或胰岛素生长因子受体I。所述被分析物和/或参照标准物可结合于多种表面。表面可以是任何可通过共价联接、被动吸收、生物素-链亲和素或任何其他本领域技术人员已知的联接而固定抗体或参照标准物的固相表面。例如，所述表面可以是珠子、平板、载玻片(slide)、纤维、表面等离子共振传感器或任何固体表面。在另一个实施方案中，所述方法在多孔板、硝酸纤维素纤维中，或在玻璃载玻片上形成。在另一个实施方案中，所述第一和第二信号是通过荧光检测的。例如，所述第一信号和第二信号可以是选自下组的信号藻红蛋白、Alexa 532、链亲和素-藻红蛋白和链亲和素-Alexa 532。在另一个实施方案中，所述信号是通过酶活性(即辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光、放射性、红外发射、荧光共振能量转移(FRET)、或任何本领域技术人员已知的其他方法来检测的。在另一个方面，本发明包含一种用于实施免疫测定来检测A β 42或tau肽的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的参照标准物。新的免疫测定标准物或校准物与天然A β 42的性能比较新的免疫测定标准物或校准物在免疫测定中应当具有与天然A 042可比较的性能。天然全长Αβ42肽可以利用标准的固相技术合成，或者可以从多家供货商作为目录产品商购(Anaspec Inc. , American Peptide Company,或 Invitrogen Inc. ) 可以使用标准方法，利用本领域公知的质量分析技术，如氨基酸分析(Kanu et al. , Journalof Mass Spectrometry, 43:1-22(2008);Bernstein et al. , Journal of AmericanChemical Society,127:2075-2084(2005) ; Li et al. , Encyclopedia of AnalyticalChemistry, Meyers, R. A. , ed. , John Wiley &Sons Ltd. (2009)),根据截短的种类验证全长构建物的丰度。
举例而言，表I列出了 Ae4Ji的理想的物理性质，以及多种用于测试这些性质的方法。这些方法可以用来确定参照标准物的这些性质是否与天然A β 42肽的这些性质可比较。表I
权利要求
1.一种组合物，其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域，和接头区域。
2.一种组合物，其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域，和接头区域，其中所述组合物用作免疫测定中的參照标准物。
3.权利要求2的组合物，其中所述免疫测定选自下组夹心免疫測定、単一抗体免疫测定、双夹心免疫測定、和竞争測定。
4.权利要求I或2的组合物，其中所述N-末端免疫反应性区域结合Aβ 42。
5.权利要求I或2的组合物，其中所述C-末端免疫反应性区域结合Aβ 42。
6.权利要求I或2的组合物，其中所述接头区域是非免疫反应性域。
7.权利要求6的组合物，其中所述接头区域包含选自下组的接头聚こニ醇、谷氨酰胺残基、丙氣酸残基、赖氣酸残基、脂质、球状蛋白质、核酸、和烧基链。
8.一种分离的修饰肽分子，其具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO: I, 2, 3,4, 5,6,7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26 和 27。
9.一种测量生物样品中被分析物的量的方法，所述方法包括 (a)将參照标准物附接于至少两种珠子，从而形成第一珠子组和第二珠子组，其中所述參照标准物包含被第一检测抗体识别的表位，且其中每个珠子组包含不同浓度的所述參照标准物； (b)将对所述被分析物特异的捕捉抗体附接到第三珠子组上； (C)将全部所述珠子组混合到一起形成悬浮阵列； (d)将生物样品施加于该悬浮阵列，藉此所述被分析物结合于所述第三珠子组上的捕捉抗体； (e)添加第一检测抗体到该悬浮阵列，其中所述第一检测抗体结合所述參照标准物和结合于所述捕捉抗体的被分析物； (f)測量来自结合于所述第一珠子组中的參照标准物的第一检测抗体的第一信号； (g)測量来自结合于所述第二珠子组中的參照标准物的第一检测抗体的第二信号； (h)基于所述第一和第二信号产生标准曲线；和 (i)通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较来确定该第三珠子组中被分析物的量。
10.权利要求9的方法，其中所述參照标准物包含权利要求1、2或8的组合物。
11.权利要求9的方法，其中所述生物样品选自下组血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞、组织、脑脊液、和细胞。
12.权利要求9的方法，其中所述被分析物选自下组:Αβ42、Αβ4(ι、Αβ38、 &ιι、和胰岛素生长因子受体I。
13.权利要求9的方法，其中所述方法是在多孔板、硝酸纤维素滤材、玻璃纤维或玻璃载玻片上进行的。
14.权利要求9的方法，其中所述第一信号和第二信号是选自下组的信号藻红蛋白、Alexa 532、链亲和素-藻红蛋白、和链亲和素-Alexa 532。
15.ー种用于实施免疫測定以检测ム042肽的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1、2或8的组合物。
全文摘要
本发明提供了用于创建定量标准物以校准被分析物的新组合物和方法。这些组合物为创建用于分析被分析物和测量临床生物标志物的标准物和校准物提供了条件。还提供了包含所述新组合物用于测定，例如夹心免疫测定的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102859363SQ201180018175
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者P.赖恩, C.马佩利, O.王, F.伯里沙, R.J.尼利 申请人:百时美施贵宝公司